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那麼，AAV 到底是什麼呢？

腺相關病毒 (AAV) 於 1965 年首次由 鮑伯·艾奇森和華萊士·羅，他們觀察到它們是腺病毒樣本中複製缺陷的顆粒。屬於 依賴細小病毒 屬內的 細小病毒科 AAV 家族的獨特之處在於它們依賴輔助病毒（例如腺病毒或單純皰疹病毒）來完成複製。在沒有輔助病毒的情況下，AAV 在宿主細胞中保持休眠狀態，不會引起疾病，這使得它們對於基因傳遞應用來說異常安全。

在野生型形式中，AAV 可以在 Rep 蛋白的引導下整合到人類 19 號染色體 (AAVS1) 上的特定位點。然而，重組 AAV (rAAV) 是在沒有 Rep 的情況下進行設計的，從而在細胞內保持穩定、非整合的存在。 rAAV 的這種附加型性質最大限度地降低了插入突變（外源 DNA 序列與宿主生物體基因組整合時引起的突變）的風險，從而增強了其在基因治療中的安全性。 AAV 也非常小，直徑約 25 奈米，基因組大小僅為 4.7 千鹼基 (kb)，這使得它們非常適合將基因轉移到各種細胞類型中。

和他們的 安全概況, 低免疫原性以及 針對特定組織的靈活性，AAV 已成為基因治療和研究的領先工具，推動遺傳和後天性疾病治療的進步。

AAV 作為載體的主要特徵

AAV 具有多種獨特的特性和成分，使其成為研究和治療應用的寶貴載體。

AAV 基因組和組件

AAV 基因組是一種約 4.7 kb 的小型單股 DNA (ssDNA) 分子，由兩個重要的開放閱讀框架 (ORF) 組成：

1. 複製基因（聲望) ORF 編碼四個非結構複製基因
2. 衣殼基因（帽) ORF 編碼三個結構衣殼基因。

內的其他 ORF 帽 編碼膜相關輔助蛋白（MAAP）和組裝活化蛋白（AAP）的基因已被鑑定，但其功能仍不清楚。

AAV 的主要特徵包括：

• 倒置末端重複序列 (ITR)： 位於 AAV 基因組兩端的兩個 145 個鹼基的 ITR 在 AAV 複製中發揮關鍵作用。這些重複允許鹼基配對以實現互補 DNA 鏈的合成。
• 代表基因： Rep 基因編碼 AAV 生命週期必需的蛋白質，包括複製和包裝所需的 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40。
• 蓋帽基因： Cap 基因編碼三種衣殼蛋白（VP1、VP2 和 VP3），它們以 1:1:10 的比例形成病毒衣殼，使 AAV 能夠靶向特定組織。

對於基因治療應用，將感興趣的轉基因插入 AAV 轉移質粒內的兩個 ITR 之間。 Rep 和 Cap 基因在生產過程中分別以反式形式提供。

AAV 輔助病毒需求

作為一種無法複製的病毒，AAV 需要輔助病毒或輔助質粒來活化。輔助質粒提供介導 AAV 複製所需的腺病毒基因—E4、E2a 和 VA。在實驗室環境中，AAV 轉移質粒（包含轉基因）、Rep/Cap 質粒和輔助質粒共轉染至 HEK293 細胞中，該細胞還提供腺病毒 E1 基因以產生感染性 AAV 顆粒。

用於基因治療的 AAV 血清型和組織趨向性

AAV 的血清型表現出顯著的多樣性，每种血清型都具有獨特的組織向性，這意味著它們對特定的細胞類型和組織具有天然的偏好。這種多樣性使科學家能夠選擇合適的 AAV 血清型來靶向特定的組織或器官，這在基因治療和研究應用中都至關重要。

AAV 血清型之間的天然衣殼變異會影響每种血清型與某些細胞受體的結合程度，最終影響哪些組織最有效地轉導。透過選擇合適的血清型，研究人員可以增強轉基因向目標組織的傳遞，同時最大限度地減少脫靶效應。

AAV 為基因療法提供了眾多優勢，包括：

1. 安全簡介：AAV 不具有致病性，免疫原性低，可降低不良免疫反應的風險。
2. 長期基因表達：它們促進治療基因的延長表達，對慢性病有益。
3. 組織向性：其不同的血清型可選擇性地遞送至特定組織，進而提高治療效果。
4. 最小插入誘變：AAV 通常保持遊離狀態，最大限度地降低致癌轉化的風險。

以下是一些最常用的 AAV 血清型及其首選組織標靶的概述：

AAV血清型	目標組織	簡介
腺病毒1	骨骼肌、心臟	肌肉組織中的高轉導效率
腺病毒2	廣泛（肝臟、肌肉、中樞神經系統、眼睛）	研究最多的血清型，有利於基因治療研究
腺病毒5	肺、中樞神經系統	優選針對肺部和神經元
腺病毒6	肺、肌肉	對肺和肌肉基因轉移有效
腺病毒8	肝臟、肌肉	高肝向性，常用於肝臟標靶治療
腺病毒9	心臟、中樞神經系統、肝臟	能夠穿過血腦屏障，可用於中樞神經應用
AAV-DJ	廣闊	專為多種組織類型的高轉導效率而設計

在設計基於 AAV 的療法或研究時，血清型的選擇至關重要，因為它直接影響基因傳遞的功效和安全性。例如：

• 腺病毒8 以及 腺病毒9 由於它們在這些組織中的轉導效率高，因此經常被選用於肝臟和肌肉應用。
• 腺病毒9跨越血腦障壁的能力擴大了其在神經系統疾病（如脊髓性肌肉萎縮症（SMA）和某些類型的肌肉營養不良症）基因治療中的應用。
• 腺病毒2 由於其對視網膜層的良好滲透性，經常用於眼部基因治療，特別是視網膜疾病。

透過利用每種 AAV 血清型的獨特趨向性，科學家可以設計針對特定組織的載體，從而實現精確的基因傳遞並最大限度地減少對非目標組織的潛在副作用。此外，衣殼工程和假型化（將一种血清型的衣殼與另一种血清型交換）進一步完善了這些靶向能力，為更廣泛的治療和研究應用打開了大門。

AAV 的作用機制

AAV 的作用機制涉及幾個關鍵步驟，從進入宿主細胞到治療基因的表達。了解這一過程對於優化基因治療應用的 AAV 至關重要。以下是 AAV 功能的詳細概述：

1. 進入宿主細胞： AAV 主要透過受體介導的內吞作用進入宿主細胞，這使得它們能夠與細胞表面的特定受體結合。這種相互作用通常涉及 AAV 上的病毒衣殼蛋白與硫酸乙醯肝素蛋白聚醣、AAV 受體 (AAVR) 和其他細胞激素等受體的結合。這種結合觸發病毒的內化，導致其進入細胞質。
2. 內體逃脫： 一旦進入細胞，AAV 就會被封裝在核內體中。為了啟動下一階段，AAV 必須逃離內體室。這種逃逸可以透過衣殼中 pH 依賴性的變化而發生，從而導致內體膜融合肽的暴露，從而允許 AAV 將其基因組釋放到細胞質中。
3. 運輸至細胞核： 逃離內體後，AAV 將其 ssDNA 基因組轉運至細胞核。核孔複合物促進了這一步驟，允許小顆粒通過。
4. 基因組轉換與基因表現： 在細胞核中，由於宿主細胞的 DNA 修復機制，AAV 基因組從單股形式轉變為雙股 DNA 形式。然後，這種雙股 DNA 可以作為遊離體持續存在於細胞核中，或者對於野生型 AAV，可以透過 Rep 蛋白的作用整合到 1 號染色體上的 AAVS19 位點的宿主基因組中。
   • 對於通常缺乏 Rep 的重組 AAV，雙股 DNA 保持遊離狀態，允許轉基因穩定表達而無需整合。這種遊離性質提供了一定程度的免疫監視保護，從而實現持續的治療效果。
5. 轉基因表達： 一旦 AAV 基因組被轉化並穩定，插入 ITR 之間的轉基因就可以轉錄並翻譯成相應的蛋白質。此蛋白質的產生取決於轉移質粒中摻入的調節元件。例如，使用強啟動子可以導致高水平的轉基因表達，而組織特異性啟動子可以確保在特定細胞類型中的靶向表達。

用於基因治療的 AAV 載體

基因療法透過修飾基因表現或改變細胞和組織功能來治療疾病，包括基因替換、失去活性或引入新基因等技術。 AAV 已成為基因治療最有效的載體之一，為一系列遺傳性疾病和後天性疾病提供了有前景的解決方案。其獨特的特性——例如低致病性、穩定性和靶向組織向性——使得 AAV 特別適合將治療基因傳遞到特定細胞。這種潛力為治療先前的難治性疾病帶來了重大突破，基於 AAV 的療法成為首批獲得 FDA 批准的基因療法之一。

以下概述了 FDA 批准的主要基於 AAV 的基因療法以及適合 AAV 療法的疾病類型。

FDA 批准的基於 AAV 的基因療法

基於 AAV 的基因療法在臨床環境中取得了顯著的成功，導致 FDA 多次批准針對罕見和危及生命的疾病的療法：

• 萊伯先天性黑蒙（LCA）： 勒克斯圖納 （voretigene neparvovec-rzyl）是 FDA 批准的首批基於 AAV 的基因療法之一，透過提供 RPE65 基因的功能副本來治療 LCA。 LCA 是一種罕見的遺傳性疾病，會導致出生時嚴重視力障礙或失明。臨床試驗顯示患者視力顯著改善，凸顯了 AAV 在治療遺傳性失明方面的改變潛力。

• 脊髓性肌肉萎縮症（SMA）： 佐爾根斯瑪 (onasemnogene abeparvovec-xioi) 使用 AAV9 向 SMA 患者傳遞 SMN1 基因的功能副本，SMA 是一種影響運動神經元的嚴重遺傳疾病，可導致肌肉無力和早期死亡。 Zolgensma 已證明可顯著改善被診斷為 SMA 的嬰兒的運動功能並延長存活期。

• 血友病： 血友病基因療法利用 AAV 載體來促進凝血因子的產生，幾種基於 AAV 的治療方法取得了有希望的結果。 亨吉尼克斯 以及 貝克韋茲 使用 AAV 載體將因子 IX 傳遞給 B 型血友病患者，同時 羅克塔維亞是一種基於 AAV5 的療法，已顯示出 A 型血友病患者的 VIII 因子持續表達。這些療法為血友病治療提供了重大進步，減少了頻繁注射凝血因子的需要。

• 杜氏肌肉營養不良症（DMD）： 埃萊維迪斯 （delandistrogene moxeparvovec-rokl）可治療 DMD，這是一種嚴重的遺傳性疾病，會導致進行性肌肉無力和惡化。透過提供肌肉營養不良蛋白基因（微肌營養不良蛋白）的修飾版本，Elevidys 有助於恢復部分肌肉功能，補償功能性肌肉營養不良蛋白的缺乏，並為 DMD 患者帶來新的希望。

適合 AAV 治療的疾病類型

AAV 療法正在開發用於多種疾病適應症，特別是神經、眼科、代謝、神經肌肉和心血管疾病。每個類別都為標靶基因治療提供了獨特的機會。

• 神經系統疾病： AAV 正在探索治療帕金森氏症和亨廷頓氏症等涉及神經退化性疾病的疾病。 AAV 能夠將治療基因直接傳遞到中樞神經系統，從而實現持續表達，從而有可能改變疾病進展並改善患者的治療結果。

• 眼科疾病： AAV 療法在治療遺傳性視網膜疾病（例如萊伯氏先天性黑蒙和色素性視網膜炎）方面顯示出了前景。這些病症通常源自於特定的基因突變，使其成為旨在恢復視力的基因替代療法的理想候選者。
• 代謝性疾病： 目前正在研究 AAV 治療苯酮尿症 (PKU) 和威爾遜氏症等代謝性疾病的潛力。透過傳遞糾正代謝途徑的基因，這些療法可以幫助控制甚至逆轉這些遺傳條件的影響。

• 神經肌肉疾病： SMA 和 DMD 等疾病是 AAV 基因療法的關鍵目標。這些疾病通常是由對肌肉功能至關重要的基因突變引起的，而 AAV 可以促進治療基因的傳遞，從而促進肌肉健康和功能。

• 心血管疾病： AAV 也在心臟病領域進行了探索，它們可用於傳遞增強心臟功能或防止有害過程的基因。這種方法有可能解決從缺血性心臟病到心臟衰竭等一系列心血管疾病。

轉向更常見的疾病：

雖然最初的 AAV 療法主要針對罕見疾病，但人們越來越有興趣將這些方法擴展到更常見的疾病。隨著研究的進展，我們的目標是利用 AAV 技術治療更廣泛的疾病，解決更多患者群體中未滿足的重大醫療需求。這種轉變是由基因治療的進步以及對 AAV 為罕見和流行疾病提供持久治療的潛力的日益了解所推動的。

AAV 的挑戰與局限性

AAV 在基因治療方面具有巨大潛力，但也存在研究人員和臨床醫生必須解決的限制：

• 預先存在的免疫力： 許多人體內已有針對常見 AAV 血清型的中和抗體，這是由於先前接觸過野生型 AAV 而產生的。這會降低 AAV 介導的基因傳遞的功效，特別是在臨床環境中。為了解決這個問題，研究人員使用患者篩檢和血清型選擇策略來盡量減少免疫幹擾。
• 有限的基因改造能力： AAV 載體的最大包裝容量約為 4.7 kb，這限制了它們可以攜帶的治療基因或有效負載的大小。較大的治療基因或複雜的基因構建體可能需要雙 AAV 系統或替代方法來提高遞送效率。
• 轉導效率的變化： AAV 轉導效率在所有組織和細胞類型中並不統一，受到血清型選擇、給藥途徑和特定細胞受體存在的影響。研究人員必須針對每個應用程式仔細最佳化這些變量，以實現有效且有針對性的基因傳遞。
• 遊離穩定性： 雖然 AAV DNA 大部分保持遊離狀態，降低了插入突變的風險，但這種遊離形式在分裂細胞中可能不太穩定，可能影響長期治療基因表現。
• 潛在的遺傳毒性：雖然 AAV 通常表現出良好的安全性，但如果 AAV DNA 整合到宿主基因組中，仍然存在插入突變的風險。這種整合可能導致致癌轉變，需要徹底的安全性評估，特別是對於長期治療。
• 製造和質量控制： 推進 AAV 基因療法的一大障礙在於製造和品質控制。目前的生產方法通常需要大型專業設施、高昂的勞動力成本和廣泛的開發時間才能滿足臨床級 GMP 標準。學術實驗室開發的傳統方法難以規模化，而且批次之間的差異使生產更加複雜化，可能會影響安全性和有效性。確保完整、功能性衣殼的高比例也具有挑戰性，因為不一致的比例可能會稀釋所傳遞的治療劑量。此外，衣殼有時會包裝非預期或非治療性的 DNA 序列，引發安全性問題。產能限制、缺乏訓練有素的專家以及嚴格的監管標準進一步增加了生產一致、高品質 AAV 產品的複雜性和成本。

研究環境中的 AAV

AAV 不僅在基因治療中發揮作用，而且在各種研究應用中也是有價值的工具。它們能夠精確且有效率地傳遞遺傳物質，這使得它們對於基因工程、轉基因表現和創建敲除模型至關重要。此外，CRISPR 技術與 AAV 的整合正在徹底改變基因研究領域。

基因工程和轉基因表達

AAV 廣泛應用於基因工程中，以促進轉基因在兩種細胞中的表達 體外 以及 体内 設定.研究人員利用 AAV 載體將新基因引入生物體，從而研究基因功能、蛋白質交互作用以及基因修飾對錶型的影響。使用 AAV 進行基因轉殖表現的好處包括：

• 高效率：AAV 可以轉導多種細胞類型，從而導致高水平的轉基因表達。
• 長期表達：一旦遞送，轉基因可以在宿主細胞核中保持遊離狀態，從而允許持續表達，而沒有與隨機整合相關的風險。
• 最小的免疫原性：AAV 通常在宿主生物體中具有良好的耐受性，從而降低了可能損害研究結果的免疫反應的可能性。

這種能力促進了模擬人類疾病的動物模型的產生，為疾病機制和潛在的治療介入提供了重要的見解。

基因敲除模型和 CRISPR 應用中的 AAV

AAV 透過向特定基因標靶提供 CRISPR/Cas9 等工具，在創建用於研究基因功能的敲除模型方面發揮關鍵作用。敲除模型使研究人員能夠滅活基因，深入了解基因功能、遺傳交互作用和潛在的治療標靶。

透過將 AAV 與 CRISPR 技術結合，研究人員可以傳遞 Cas9 和引導 RNA (gRNA)，以誘導目標基因的雙股斷裂。修復過程中引入的錯誤有效地消​​除了感興趣的基因，使研究人員能夠研究其功能和影響。

AAV 和 CRISPR 之間的協同作用透過在生物體中實現有針對性的、高效的基因編輯，開闢了基因研究的新領域。這種組合具有以下幾個優點：

• 標靶基因編輯： 針對特定組織設計的 AAV 使研究人員能夠將 CRISPR 組件精確引導至感興趣的位點，從而最大限度地減少脫靶效應。
• 多路復用能力： AAV 可以同時傳遞多個 gRNA，從而可以同時敲除或修改多個基因——這是研究複雜遺傳性狀或疾病的寶貴方法。
• 體內 應用環境： 使用 AAV 傳遞 CRISPR 組件 体内 促進生物體中的基因編輯，增進我們對基因功能的理解並擴大治療開發的可能性。

透過敲除模型和基因編輯應用，AAV 與 CRISPR 技術相結合正在徹底改變基因研究，並為新型治療策略鋪平道路。

綜上所述

AAV 代表了基因治療和基因研究的多功能且有前途的平台。它們獨特的特性，例如長期基因表現、低免疫原性和針對多種組織的能力，使它們成為開發遺傳性疾病、神經系統疾病等新療法的基石。

隨著研究的進展，AAV 與 CRISPR 等尖端技術的整合正在增強我們研究基因功能和開發有效治療方法的能力。然而，與預先存在的免疫力、基因改造能力限制、擴大 AAV 生產的複雜性以及潛在的遺傳毒性相關的挑戰需要仔細考慮和持續研究以優化 AAV 應用。

透過應對這些挑戰並利用 AAV 的優勢，科學家和臨床醫生有望開闢新的途徑來理解複雜的生物過程和開發創新的治療策略。 AAV 在研究和臨床環境中的前景都是光明的，並且有可能改變遺傳醫學的模式。

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