冷凍保存是 細胞和基因治療 研究，使 長期儲存 以及 運輸 生物材料，同時力求保持其活力和功能性。對於敏感細胞類型－例如 間質幹細胞（MSCs）、CAR-T 細胞和誘導性多能幹細胞 (iPSC)——這個過程風險特別高，其中冷凍介質的每個成分都可能決定治療的成功或失敗。

為了減輕冰晶形成的破壞作用，冷凍保護劑如 二甲基亞砜（DMSO） 以及 蛋白質， 通常以胎牛血清（FBS）或人類血清白蛋白（HSA）的形式使用。然而，如果不仔細管理，這些添加劑會帶來很大的風險，特別是用於臨床應用的細胞。

在這篇部落格中，我們探討了冷凍保存介質中 DMSO 和蛋白質的隱藏陷阱——從細胞毒性和批次變異性到免疫原性問題——以及為什麼研究人員必須謹慎對待這些成分。徹底了解這些風險對於制定優化的冷凍保存策略至關重要，以確保細胞和基因療法的可靠性、安全性和治療潛力。

細胞和基因治療中的當前冷凍保存策略

細胞和基因療法的成功取決於在不損害細胞產品活力、功能或治療潛力的情況下保存細胞產品的能力。 冷凍保存—將細胞冷卻至超低溫（通常使用液態氮約為-80°C或-196°C）的過程—停止代謝活動，從而實現長期儲存和運輸。然而，冷凍和解凍過程本身也帶來了重大挑戰，包括 冰晶的形成, 滲透脅迫以及 氧化損傷，所有這些都會損害細胞的存活和表現。

為了降低這些風險，最佳化的冷凍保存方案必須平衡冷卻速率、儲存條件和使用 冷凍保護劑（CPA）。 通常採用兩種主要方法：

一種廣泛使用的方法，將細胞冷卻至 控制速率約為每分鐘 −1°C。此速率允許 水離開細胞質，然後部分被 DMSO 等 CPA 取代。目的是 盡量減少細胞內冰的形成，這會導致膜破裂和活力喪失。

冷卻速度與 細胞膜通透性確保在冰晶形成前有足夠的時間進行水流出和CPA吸收。慢速冷凍通常採用 控溫冷凍機 or 冷凍容器.

這種技術因其 低污染風險、最少的手動操作以及跨細胞類型的廣泛適用性—包括用於細胞和基因治療研究的細胞類型。它還能提供一致的結果，而無需專門的冷凍保存專業知識。

An 超快速冷卻技術 將水性細胞懸浮液直接暴露於液態氮中，使溶液立即轉變為 玻璃狀、無冰狀態。這種方法避免了冰晶的形成，從而避免了破壞細胞結構，使玻璃化特別有效 高度敏感的細胞 如 卵母細胞和某些幹細胞.

在冷卻之前，細胞或組織暴露於 高濃度的註冊會計師-通常 40–60%（重量/體積）—防止冰核形成。為了成功，玻璃化需要 極快的冷卻和升溫速度，同時仔細控制變量，例如 樣本量, 粘性和 CPA 混合物的精確配方.

雖然玻璃化提供了 最大程度減少凍害的主要優勢 和保存 解凍後活力高，它帶來了一些挑戰。其中包括 CPA毒性，需要 精確的操作技巧，配備 不可忽視的微生物污染風險—尤其是在開放系統中。因此，玻璃化最適合於維持細胞完整性至關重要並且可以確保技術專業知識和嚴格無菌條件的應用。

儘管取得了這些進步，註冊會計師的選擇仍然是一個關鍵變數。蛋白質（例如血清白蛋白）和 DMSO 等小分子添加劑被廣泛使用，但在安全性、一致性和解凍後恢復方面存在不足。以下章節探討了細胞和基因治療應用中這些關鍵成分的優點、限制和風險。

DMSO 在冷凍保存中的作用：平衡功效與毒性

自過去 60 年來推出以來，DMSO 一直是冷凍保存的基石，徹底改變了活細胞的長期儲存方式。作為最 廣泛使用的穿透CPA，對於保存敏感細胞類型是必不可少的。然而，儘管 DMSO 有效，但它也帶來了重大挑戰——從細胞毒性到臨床副作用——這促使研究人員尋求更安全的替代品。

為什麼 DMSO 是冷凍保存的黃金標準

二甲基亞砜 長期以來一直被認為是黃金標準 CPA，因為它 獨特的穿透細胞膜的能力 以及 防止細胞內冰形成，這是冷凍過程中細胞受損的主要原因。

其占主導地位的關鍵原因：

• 膜通透性：DMSO 迅速進入細胞並與細胞內環境達到平衡。透過減少可凍水的量，可以防止細胞內部形成冰晶。
• 低濃度有效：通常用於 5–10%（體積比），DMSO 提供了出色的保護作用，而不需要過高的濃度來增加毒性。
• 廣泛的適用性：DMSO 與 多種細胞類型—包括造血幹細胞、MSCs、淋巴細胞和各種原代和永生化細胞系－使其成為研究和臨床應用的多功能工具。
• 臨床驗證: DMSO 在 臨床冷凍保存方案，包括造血幹細胞移植。其功效和安全性已在監管框架中得到充分證實。
• 成本效益和可用性：它廣泛可用，在室溫下穩定，而且經濟實惠，使其成為研究實驗室和商業生物庫的實用選擇。

DMSO 的主要限制和風險

儘管 DMSO 在研究和臨床冷凍保存中已廣泛應用，但它也存在很大的風險。它的細胞毒性、損害細胞功能的可能性以及臨床副作用引起了人們對其長期適用性的嚴重擔憂——尤其是在 細胞和基因治療應用其中產品完整性和病人安全至關重要。

1. 細胞毒性和功能障礙

雖然 DMSO 可以有效防止細胞內冰的形成，但它本質上 對細胞有毒對於某些敏感細胞類型，即使濃度低至 5–10%。

• 細胞代謝紊亂：DMSO 可能會損害 粒線體呼吸，誘導 氧化應激和損害 細胞膜。這些影響在解凍階段尤其明顯，因為此時細胞最脆弱。
• 解凍後活力和功能的喪失：某些免疫細胞－例如 自然殺傷細胞, 樹突細胞以及 CAR-T細胞—對 DMSO 暴露高度敏感。解凍後，這些細胞可能會顯示減少 可行性, 增殖能力以及 效應功能，限制了它們的治療效用。
• 表觀遺傳和轉錄擾動：長期暴露於 DMSO 可能導致 基因表達的變化 以及 表觀遺傳修飾，這可能會損害 效力、身份和穩定性 治療細胞產品。這些影響可能會為製造業帶來變化，並引起對法規遵循的擔憂。

2. 患者的臨床副作用

輸注含有 DMSO 的細胞產品可能會導致 患者不良反應，特別是涉及大量或高濃度時。

• 急性輸液相關反應：常見的副作用包括 噁心、嘔吐、腹部絞痛、低血壓或高血壓，並且在某些情況下， 類似過敏反應
• 心血管和神經系統事件：在罕見但嚴重的情況下，DMSO 輸注與 心搏過緩、癲癇和腦病—尤其是兒童或免疫功能低下的患者
• 溶血風險：殘留的 DMSO 可能導致 紅血球膜不穩定性如果輸液中含有紅血球成分或解凍後未徹底清洗，則可能導致溶血

3. 監管和製造挑戰

DMSO 帶來了一些挑戰，使細胞療法的擴大和臨床轉化變得複雜：

• 臨床級 DMSO 要求： 當用於細胞治療生產時，DMSO 必須滿足 嚴格的品質標準 （例如，USP 或 Ph. Eur. 等級），且其處理需要仔細記錄以滿足良好生產規範 (GMP) 環境的監管要求。
• 供應商之間的不一致： 不同製造商的 DMSO 的純度和性能可能有所不同，這可能會影響冷凍保存方案的可重複性。當擴大監管備案或臨床級生產流程時，這種不一致性就變得至關重要。
• 下游加工負擔： 解凍後移除殘留的 DMSO（通常透過稀釋或清洗）會增加時間和複雜性。這些步驟可能導致嚴重的細胞流失、功能改變或活化誘導的細胞凋亡，最終 降低產量和產品一致性.
• DMSO 最小化的產業趨勢： 雖然沒有強制要求，但許多開發人員積極主動 降低 DMSO 濃度 或探索 不含 DMSO 的替代品 以滿足人們對更安全、更明確的細胞治療產品不斷變化的期望。

為什麼蛋白質需要冷凍保存

蛋白質－特別是血清衍生的蛋白質，如 白蛋白 以及 FBS—在傳統冷凍保存協議中發揮多種關鍵作用。它們的加入有助於減輕冷凍和解凍過程引起的機械、滲透和氧化壓力對細胞造成的損害。

1. 膜穩定和冰重結晶抑制

在冷凍保存過程中，細胞容易受到 冰晶引起的機械性損傷特別是在解凍過程中，重結晶會加劇損傷。蛋白質有多種作用：

• 表面保護：蛋白質如 白蛋白 吸附到細胞膜上，形成 水合保護層 最大限度地減少與冰晶的直接接觸。這種緩衝作用可減少膜破裂和機械應力
• 冰重結晶抑制：有些蛋白質模仿自然界中發現的抗凍蛋白的作用，有助於 調節冰晶生長 以及 抑制再結晶這對於保存幹細胞和免疫細胞等脆弱的細胞類型至關重要。
• 膠體穩定性：白蛋白和其他蛋白質起著 膠體穩定劑，防止 細胞聚集 或在冷凍和解凍階段結塊。這提高了細胞懸浮液的均勻性並有利於更容易的下游處理。

2. 緩解滲透和氧化壓力

凍融循環對 滲透壓變化和氧化壓力，這兩者都會損害細胞活力。

• 滲透保護：蛋白質有幫助 緩衝滲透失衡 透過調節跨膜的水運動和溶質濃度。這減少了 細胞過度收縮或腫脹否則會造成不可逆的膜損傷。
• 抗氧化能力：血清類冷凍保存劑（如 FBS）天然含有 抗氧化劑，包括 穀胱甘肽和過氧化氫酶，有助於中和 活性氧（ROS） 解凍過程中產生的。這種抗氧化緩衝作用可以限制對細胞成分的氧化損傷，並防止 細胞凋亡級聯 由壓力引發。

3. 生長因子和解凍後恢復支持

除了在冷凍保存期間提供直接保護外，蛋白質還有助於 解凍後恢復，特別是對於敏感或代謝活躍的細胞：

• 生物活性：FBS 富含 生長因子、荷爾蒙、細胞激素、脂質和維生素。這些分子支持細胞 代謝、增殖和修復 解凍後的機制。
• 幹細胞支持： 如果是 間充質乾細胞、造血幹細胞（HSC）和原代細胞，FBS 中的複雜環境可以增強 恢復和重新附著，加速恢復正常功能。

蛋白質添加物－並非總是無害的

雖然蛋白質 FBS, HSA， 或者 血漿衍生物 因其保護作用而被廣泛應用於冷凍保存，它們具有 重大風險—尤其是在開發時 臨床級或可重複的研究產品。這些風險在以下情況下尤其令人擔憂： 細胞和基因治療其中產品的一致性、純度和安全性至關重要。

1. 批次間差異

生物衍生蛋白質（尤其是 FBS）最迫切的問題之一是 批次間差異。即使來自同一供應商，不同批次的蛋白質含​​量、滲透壓或存在不明確因素也可能有所不同。這種變化可能導致：

• 不可預測的冷凍保存結果，包括不一致的細胞活力和恢復。
• 困難中 擴大 或將協議從研究轉移到 GMP 設定。
• 面臨的挑戰 工藝驗證，這是獲得監管部門批准的關鍵一步。

2. 免疫原性和污染風險

來自動物或混合人類血漿的蛋白質可能會引入不必要的 異種抗原或同種抗原，這可能會引發 免疫反應 在患者中—特別是在同種異體細胞療法中。

此外，這些蛋白質補充劑還存在以下風險 生物污染物其中包括：

• 內毒素 這可能會引發細胞激素風暴。
• ions病毒 或逃避過濾的病毒顆粒。
• 未知的外來因素 這在監管檢查中引起了警覺。

即使是「臨床級」人類血白蛋白也未必完全沒有風險。這些污染物的存在使 GMP生產 以及 監管許可 用於臨床應用。

3. 對下游應用的干擾

除了安全問題外，蛋白質添加劑還可能 使下游流程複雜化特別是在 基因治療和EV研究:

• 中 轉導 or 電穿孔，蛋白質可以 抑制病毒進入，降低轉染效率，或促進聚集。
• In 細胞外囊泡（EV） 研究表明，血清來源的蛋白質可能 污染電動汽車製劑，導致假陽性結果或受損的生物標記分析。
• In 蛋白質體學或組學工作流程，殘留蛋白質可能會引入 背景噪音，掩蓋關鍵訊號或引入偽影。

邁向定義，Xeno- 免費 替代品

上述安全、監管和供應鏈壓力加速了從 「經典」FBS + 10％DMSO 食譜 化學地- 已定義，異種- 免費冷凍保存 系統。許多商業製造商已經開發出下一代培養基，以重組或合成穩定劑取代血清和其他動物衍生成分，在許多情況下，顯著減少或完全消除 DMSO。

最好- 採用已定義 Xeno 的實務清單- 免費媒體

CryoEase-PF：更安全、更精準的敏感細胞保存方案

CryoEase-PF是 Atlantis Bioscience 新推出的細胞冷凍保存介質，解決了與 DMSO 和血清蛋白等傳統冷凍保存劑相關的挑戰。這 化學成分明確的無外來物質溶液 專為保存和運輸敏感細胞（包括 MSCs）而配製。

主要優勢：

• 不含 DMSO 和蛋白質的成分： 透過消除 DMSO 和動物源性蛋白質，CryoEase-PF 降低了細胞毒性和變異性，確保了更高的解凍後細胞活力和功能完整性。
• 雙溫度相容性： CryoEase-PF 在零下（-80°C）和低溫（4-10°C）下均有效，為各種儲存和運輸條件提供了靈活性。
• 增強細胞活力： 研究表明，使用 CryoEase-PF 保存的 MSCs 在 85°C 下保存 72 小時後仍可保持 4% 以上的活力，優於在類似條件下活力低於 75% 的其他配方。
• 保持功能完整性： 解凍後，MSCs 表現出一致的群體倍增時間並保留其三系分化潛力，符合國際細胞和基因治療學會 (ISCT) 設定的標準。
• 符合 GMP 標準的材料： CryoEase-PF 採用符合 GMP 標準的材料製成，支持從研究到臨床應用的無縫過渡，甚至跨越國界。

CryoEase-PF 的創新配方 簡化物流 透過減少對複雜 冷鏈系統使其成為全國和國際敏感細胞運輸的理想選擇。它與兩者的兼容性 短期低溫儲存 以及 長期冷凍保存 為研究人員和臨床醫生提供了一種在運輸和儲存過程中保持細胞品質的多功能解決方案。

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