類器官和球體代表了生物學研究的突破，提供了先進的 3D 模型，比傳統的 2D 培養物更準確地模仿人體組織的結構和功能。這些三維結構是透過在促進自組織的特殊環境中培養細胞而創建的，形成具有類似於體內器官特徵的複雜組織。

類器官和球體有什麼差別？

• 類器官 是器官的微型版本，由幹細胞或器官特異性祖細胞生長而成，能夠發展出多種細胞類型，甚至具有各自器官的一些功能特性。源自肝臟、腎臟、大腦或腸道等組織的類器官為研究人員提供了一個強大的模型來研究器官發育、疾病進展，甚至對藥物的反應。
• 球體另一方面，是更簡化的 3D 細胞聚集體，缺乏類器官中所見的組織複雜性，但仍在 2D 細胞培養物和更複雜的細胞培養物之間提供了重要的橋樑 体内 模型。癌細胞可以形成球體，使研究人員能夠研究腫瘤行為、抗藥性以及癌細胞與其微環境之間的相互作用。

任何一種 類器官和球體 正在改變癌症生物學、藥物發現、毒理學和再生醫學等研究領域。透過提供更生理相關的模型系統，它們使研究人員能夠：

• 研究複雜的細胞與細胞、細胞與基質的相互作用。
• 更準確地建立疾病模型，包括患者的具體情況。
• 在進行動物模型或臨床試驗之前，以更具預測性的方式測試藥物功效和毒性。

它們在研究中日益重要，凸顯了需要精確的方法來視覺化和研究這些 3D 結構，這使得染色和成像對於獲得對其生物學的有意義的見解至關重要。

3D 類器官和球體染色

由於 3D 類器官和球體的尺寸、緻密的細胞組成以及保持其結構完整性的需要，對用於研究的 XNUMXD 類器官和球體進行染色是一個複雜的過程。本節重點介紹主要挑戰，並提供優化染色和成像的實用技巧。

1. 3D 結構染色的挑戰

• 污漬滲透有限： 由於類器官和球體的大小和密度，污漬可能無法均勻滲透，特別是在核心區域。為了確保均勻分佈，請優化染色劑和抗體的濃度並延長孵育時間（如果需要，最長可達 72 小時）。輕輕攪拌也有助於提高污漬滲透力。
• 高背景訊號： 細胞外基質 (ECM) 或細胞碎片的自發性螢光會幹擾特定染色，導致高背景雜訊。光學透明方法或自發螢光猝滅劑可以幫助減少這個問題，提高訊號雜訊比。
• 保留 3D 結構： 類器官和球體非常脆弱，染色過程可能會損壞其結構或使其結構變形。使用軟移液管進行溫和處理、嵌入水凝膠和低速離心是在染色過程中保持這些 3D 培養完整性的有效方法。
• 固定問題： 固定過度會阻止污漬滲透，而固定不足會導致訊號微弱。應優化固定方案，通常使用 4% 多聚甲醛固定 15-60 分鐘，取決於類器官或球體的大小。根據初步測試調整協議。

2. 有效染色的技巧

• 優化透化： 有效的透化對於讓染色劑更深入地滲透到類器官中至關重要。使用具有最佳化濃度和孵育時間的 Triton X-100 (0.1-0.5%) 等試劑可以增強染色效果，而不會損壞結構。
• 延長孵育時間： 鑑於 3D 模型的大小，通常需要更長的孵化時間。延長染色孵育 24-72 小時可確保染料或抗體滲透到球體或類器官的內層。
• 多步驟溫和洗滌： 溫和的多步驟清洗對於去除多餘的染色試劑而不干擾精緻的 3D 結構至關重要。在洗滌步驟中使用低速離心或重力沉降，以防止遺失或損壞。

3. 適應成像技術

• 共焦顯微鏡與光片顯微鏡： 傳統的共焦顯微鏡非常適合薄切片切片，但對於類器官等較厚的 3D 結構可能會受到限制。光片或雙光子顯微鏡可以為較厚的樣品提供更好的可視化效果，並且可以更有效地捕捉 3D 整個結構。
• Z 軸堆疊與 3D 重建： 為了實現類器官和球體的完整可視化，Z 軸堆疊至關重要。透過取得多個焦平面的影像，研究人員可以重建 3D 結構。採集後影像重建和分析軟體（例如，Imaris，斐濟）可以在此過程中提供幫助。
• 光學清除： 類器官通常是不透明的，這會降低成像清晰度。光學透明技術增強了透明度，可以在不影響染色的情況下更好地觀察內部結構。

4. 常見陷阱以及如何避免它們

• 過度染色： 過度染色會掩蓋特定訊號並導致標記不均勻，特別是在球體的外層。仔細滴定染色劑並運行對照以確定最佳濃度。
• 安裝媒體不足： 封片劑和染色樣品之間的折射率不匹配會導致影像品質不佳。使用專為 3D 組織設計的封片劑將確保最佳成像和最小失真。

球體染色的基本方案

正確的染色技術對於可視化細胞結構和評估球體內特定蛋白質的表達至關重要。本節概述了球體染色的簡要方案，包括固定、染色和成像。

步驟：

1. 固定

• 使用寬孔移液器尖端輕輕收集球體並轉移到 1.5 mL 離心管中。讓球體沉澱並小心吸出上清液。
• 小提示: 用 PBS 中的 1% BSA 預塗吸頭和離心管可能有助於確保最大轉移效率。
• 在室溫下將球體固定在 4% 多聚甲醛 (PFA) 中 15-20 分鐘，然後用 50 mM Tris/HCl (pH 7.4) 淬滅 30 分鐘。根據球體的大小，較大的球體可能需要較長的固定時間。
• 固定後，以 PBS 清洗球體 3 次（每次清洗 5 分鐘）。
• 注意：細胞可在 4°C 下長期保存（>1 年）。

牛血清白蛋白 (BSA) 凍乾 pH~7

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杜爾貝科磷酸鹽緩衝鹽水 (DPBS) 10X 不含鈣 不含鎂 10L

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2. 透化

• 將球體在含 0.1-1.0% Triton X-100（或替代透化劑）的 PBS 中室溫孵育 3 小時。根據球體密度和要染色的分子大小調整透化時間。
• 再次以 PBS 清洗球體（清洗 3 次，每次 5 分鐘）。

3. 阻塞

• 將球體在封閉緩衝液（例如，PBS 中的 1% BSA 和 1% 驢血清）中室溫孵育 1 小時，以減少非特異性染色。
• 提示：使用產生二抗體的動物血清來降低背景。
• 注意：BSA 通常適用於封閉步驟，但如果背景噪音較高，請進行經驗測試以獲得給定抗體組合的最佳結果。
• 孵育過程中輕輕搖晃或搖晃，以確保封閉緩衝液均勻分佈。

驢血清 500ml

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4. 染色

• 準備以封閉緩衝液在 PBS 中稀釋的染色溶液（例如一抗、核染料或螢光探針）。
• 在 24°C 下將球體在染色溶液中孵育 72-4 小時。長時間的培養可確保染色劑到達球體最裡面的細胞。
• 或者，將球體保持在溫和攪拌下（例如，在搖桿或旋轉平台上）以增強滲透。

5.洗滌

• 在 PBS 中清洗球體 3-5 次，以去除未結合的污漬。確保洗滌溫和，以保持球體完整性。

6. 有趣（如果需要）

• 如果需要二抗或複染（例如，用於檢測一抗或對其他標記進行染色），請將球體與二抗染色溶液在 24°C 下再孵育 48-4 小時。
• 加入 Hoechst 33342 並在 2 °C 下再孵育 4 小時
• 再用 PBS 清洗 3-5 次。
• 注意：該協議可以在此處暫停，並且樣品可以在 4°C 下避光保存數月。

赫斯特 33342

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7。 安裝

• 使用專為 3D 成像設計的安裝介質將染色球體轉移到玻片或成像室。確保介質與您的成像方法相容並最大限度地減少自發螢光。

8. 顯微鏡檢查

• 使用共焦、光片或雙光子顯微鏡對染色球體進行成像，以獲得最佳視覺化效果。確保針對 3D 樣本調整採集設定（Z 堆疊、雷射功率）。

用於球體、3D 培養物或 Matrigel® 培養物的染色劑

與 2D 培養物不同，球體在深度和組織方面存在挑戰，因此在不使用染料或染色劑的情況下很難評估細胞活力、增殖或特定生物標記。透過使用適當的染色劑，研究人員可以區分活細胞和死細胞，追蹤細胞膜和粒線體等細胞成分，甚至監測細胞凋亡等過程。這增強了我們理解 3D 環境中細胞行為、組織和治療反應的能力。

參考文獻：

Bergdorf KN、Phifer CJ、Bechard ME 等人。癌症球體和細針抽吸衍生的類器官的免疫螢光染色。 星協議。 2021；2(2):100578。 2021 年 31 月 10.1016 日發布。

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