免疫螢光 (IF) 染色是細胞生物學的基石技術，使研究人員能夠以非凡的細節可視化和研究細胞結構和蛋白質。這種廣泛的能力是透過標記有螢光團的特異性抗體的組合來實現的，這些螢光團可識別各種細胞製劑的不同類型組織中的特定抗原。然而，要在 IF 染色中獲得最佳結果，需要仔細優化各種實驗參數。在這篇文章中，我們將探討在免疫螢光成像中獲得最佳結果的關鍵技巧和最佳實踐。

1. 確定 IF 染色固定方法

固定是 IF 染色、保護形態、防止自溶和保留抗原性的關鍵步驟。針對特定樣本類型和抗原量身定制的固定劑和固定方法的最佳化對於在不影響抗原性的情況下實現固定至關重要。研究人員通常使用化學交聯劑或有機溶劑來實現這些目標。

化學交聯劑：

化學交聯劑透過交聯細胞蛋白質發揮作用，多聚甲醛 (PFA) 是 IF 染色中廣泛使用的固定劑。然而，PFA 可能會透過醛交聯損害某些標靶的抗原性。通常在室溫下以 4% 的濃度使用 10-20 分鐘，可能需要調整孵育時間、濃度和溫度以實現最佳抗體結合。有時會使用甘胺酸進行固定後洗滌來淬滅 PFA 並停止交聯反應。

有機溶劑：

有機溶劑，如丙​​酮、甲醇或乙醇，透過使細胞脫水、使細胞成分變性和沈澱來發揮作用。雖然變性可能會暴露通常隱藏的表位，對某些抗體有利，但有機溶劑不能像交聯劑那樣有效地保留樣品結構。這些溶劑可能很刺激，導致固定過程中脂質和可溶性蛋白質的流失，影響樣品結構。因此，不建議將它們用於狀態特異性抗體，例如磷酸化抗體和針對膜蛋白的抗體。有機溶劑對脂質的滲透作用加快了這個過程，節省了樣品製備的時間。

表 1：不同的固定方法

固定劑類型	固定劑	影響	優點	缺點
化學交聯劑	甲醛	透過蛋白質的遊離氨基酸交聯	保留細胞形態 基因編碼螢光蛋白的理想選擇	抗原交聯自發螢光
	戊二醛	透過蛋白質的遊離氨基酸交聯	保留細胞形態 基因編碼螢光蛋白的理想選擇	抗原交聯自發螢光
有機溶劑	甲醇	蛋白質沉澱	更快的程序透化細胞	對蛋白質表位產生負面影響 不適合螢光蛋白 可溶性分子和脂質分子的損失
	丙酮	蛋白質沉澱	保存速度更快 不會丟失很多表位	不適合螢光蛋白 可溶性分子和脂質分子的損失

2. 確定使用哪種清潔劑以及何時使用

由於脂質膜的不可滲透性，抗體是一種大型蛋白質，在進入細胞內結構時面臨障礙。透化是 IF 過程中的關鍵步驟，它在細胞膜上創建開口，使抗體能夠有效地到達細胞內標靶。是否需要單獨的透化步驟取決於所選的固定方法。

如前所述，在有機溶劑的情況下，細胞膜在固定過程中變得自然可滲透，因此無需在封閉前進行額外的透化步驟。另一方面，用化學交聯劑固定的樣品需要用去污劑進行補充處理，以實現有效的透化。通常使用 Triton X-100 或 NP-40 等常見洗滌劑，但皂苷、Tween 20 或洋地黃皂苷等替代品也可能適用。

去污劑的選擇會影響結果，影響從細胞膜上去除特定分子並為抗體進入創造不同的孔徑。因此，建議使用不同濃度和孵育時間進行實驗。典型的起始點是在室溫下用 PBS 中的 0.1% Triton X-100 進行透化 15-20 分鐘。

洗滌劑不僅限於透化步驟；它們經常被摻入封閉、洗滌和染色緩衝液中。這種多方面的用途歸因於去垢劑能夠提高封閉效率並在後續洗滌步驟中最大限度地減少非特異性抗體結合。

然而，如果您的目標位於膜的細胞外側，繞過透化步驟可能會產生更清晰的結果。這種方法可防止與仍位於細胞內的任何目標蛋白結合，從而增強 IF 染色的特異性。

3. 使用正確的封閉解決方案

為了減輕非特異性抗體結合併從而最大限度地減少背景訊號，建議在開始抗體孵育之前使用封閉溶液。至關重要的是，用於封閉的蛋白質不應與一抗來自同一物種，因為這可能會損害二抗對一抗的特異性。最有效的封閉溶液通常涉及來自產生二抗的物種的血清。例如，當使用驢子產生的針對鼠一抗的二抗時，理想的封閉試劑是 正常驢血清.

在各種情況下，1-5% 的稀釋液 牛血清白蛋白 (BSA) 被證明是一種多功能蛋白質阻斷劑，適合與任何二抗體一起使用。在整個染色方案中保留封閉劑並將其納入所有解決方案（包括抗體稀釋液）中，可確保全面且一致地減少非特異性結合，從而有助於 IF 程序的整體成功。

4. 明智地選擇您的抗體和螢光團

實現高品質 IF 染色的關鍵在於仔細選擇一抗，這項決定將對實驗的成功產生重大影響。各種類型的一抗（例如多克隆抗體、單株抗體和重組抗體）具有不同的特性。

多克隆抗體：

多克隆抗體包含異質混合物，可辨識特定抗原的不同表位。雖然多克隆抗體產生強大的訊號，但其批次間差異較大、存在交叉反應性且缺乏特異性。

單克隆抗體：

單株抗體可辨識每個抗原的單一抗原決定位，具有高特異性、低非特異性交叉反應性和最小的批次間差異。

重組抗體：

重組抗體利用已知和定義的抗體編碼序列，以最小的批次間差異提供長期、安全的供應。這一特性允許工程和操作來適應特定的應用。

除了抗體選擇之外，了解兩種主要染色技術（直接染色和間接染色）也至關重要：

直接染色：

在該技術中，螢光團直接與一抗偶聯，從而縮短了整體免疫染色時間。然而，一抗的成本可能會更高，因為每個一抗都預先與螢光團結合。

間接染色：

該方法涉及兩個步驟，包括使用未標記的一抗進行染色，然後使用螢光團偶聯的二抗來識別一抗的宿主物種。這種方法可以在復用 IF 實驗中實現訊號放大、靈活性和經濟高效的替代方案。

在進行多重 IF 染色時，請仔細考慮不同一抗的物種來源，以及結合螢光團的不同波長光譜 二抗， 是必不可少的。此外，除了光譜特性之外，螢光團的光穩定性也扮演著至關重要的角色。過度暴露在光線下引起的光漂白會影響螢光。選擇光穩定性螢光團對於確保顯微鏡結果可靠至關重要。

探索開創性 CF染料，以其無與倫比的亮度、卓越的光穩定性和出色的溶解度而聞名——這是實現最佳 IF 染色結果的基本解決方案。

表 2：多重實驗設定範例

目標	一抗	二抗	顏色	常見螢光團	亞細胞定位
DNA錶款系列	數據接口	-	藍色	數據接口	核
肌動蛋白	鬼筆環肽	-	湖水綠	CF 488	骨架
目標1	小鼠抗A	山羊抗鼠	橙紅色	CF 568	任何
目標2	兔抗B	山羊抗兔	遠紅	CF 647	任何

5. 探索可變抗體孵育時間和稀釋度

完成涉及固定、透化和封閉的樣品製備後，關鍵的免疫反應階段開始。在此階段，引入特定的一抗來標記樣本內所需的目標結構。為了優化此過程，建議透過抗體滴定確定最低有效濃度，範圍為 1:50 至 1:1,000。這種方法有助於確定所需的最小抗體量，同時最大化訊號背景比。抗體的親和力在決定孵育時間方面發揮重要作用，在室溫下通常為 1-2 小時。對於那些尋求增強結果的人來說，4°C 過夜孵育是一個可行的選擇。

一般來說，與較短的孵育時間和較高的抗體劑量相比，較長的孵育時間（例如，4°C，過夜）和較低的抗體濃度會產生更清晰、更強和更特異的染色模式。

6. 洗滌的重要性

儘管洗滌步驟看似常規，但它是染色方案中最關鍵的步驟之一。獲得具有最小背景訊號的高品質影像取決於每一步的徹底和仔細的清洗。這在 STORM 成像中變得尤為重要，其中每個螢光團的檢測都至關重要。

通常，使用 PBS 進行洗滌，同時添加去污劑以盡量減少非特異性抗體結合。如果時間允許，每個洗滌步驟允許幾分鐘有助於洗滌緩衝液在整個樣本中有效擴散。確保對清洗階段的精心關注對於整個染色過程的成功至關重要，這對於產生高品質和可靠的影像做出了重大貢獻。

7. 不要忽視控制的重要性

對照的缺失或濫用可能導致數據不準確和假陽性結果。當優化方案、探索不同條件或使用新抗體時，這一點變得尤為重要。包含精心設計的對照組不僅可以確保實驗設置的可靠性，還可以建立對所獲取數據的信任。

考慮以下基本控制措施：

陽性對照：

始終在 IF 實驗中加入陽性對照。這種控制對於確定染色過程中是否發生任何問題至關重要。陽性對照可以由已知目的蛋白大量表達的細胞組成，無論是內源性的還是透過過度表達的。

自發螢光控制：

分析細胞自發性螢光，特別是容易產生自發性螢光的樣本，例如腦細胞。包含僅二抗體的對照有助於區分觀察到的螢光是否源自於背景自發螢光。

抗體非特異性結合對照：

僅使用二抗（不含一抗）對樣本進行染色，以揭示觀察到的訊號是否為組織或細胞樣本內二抗非特異性結合的結果。

同種型對照：

將樣本與與一抗具有相同同種型和濃度的非免疫抗體一起孵育。此對照確保任何觀察到的染色不是由一抗的非特異性相互作用引起的。

透過努力整合這些控制，您不僅可以增強 IF 數據的有效性，還可以為實驗結果的準確性建立信任基礎。

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參考

Im K、Mareninov S、Diaz MFP、Yong WH。免疫螢光染色簡介。分子生物學方法。 2019；1897：299-311。 doi：10.1007/978-1-4939-8935-5_26。電話號碼：30539454； PMCID：PMC6918834。

Jamur MC，Oliver C。細胞膜的透化。 方法分子生物學. 2010;588:63-66. doi:10.1007/978-1-59745-324-0_9