基于外泌体的疗法监管路线图：FDA、EMA 和东盟指南
2025 年 11 月 11 日
了解美国食品药品监督管理局 (FDA)、欧洲药品管理局 (EMA) 和东盟关于外泌体疗法的指导原则。了解初创企业如何从实验室到市场实现 GMP 合规。
ExoBrite™ 为何优于 PKH 和碳菁染料
ExoBrite™ 为何优于 PKH 和碳菁染料
- 亚特兰蒂斯生物科学
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细胞外囊泡 (EV) 是细胞释放到环境中的微小膜结合结构。这些囊泡充当细胞信使，将蛋白质、DNA 和 RNA 分子运送到其他细胞。在过去十年中，EV 因其作为复杂细胞成分的天然载体的潜力以及参与各种生理和病理过程而备受关注。
为什么电动汽车标签很重要？
众多的 细胞/组织 以及 体内 研究人员利用多种技术来探究 EV 的生物学功能。这些技术包括流式细胞术、共聚焦显微镜和 体内 荧光检测方法。这些技术通常依赖于标记EVs来促进其检测和分析。 标签策略 包括光学（荧光、生物发光）、核和磁共振成像（MRI）示踪剂，如图 1 所示。这些先进的方法可以全面了解 EV 的功能、相互作用以及在生理和病理过程中的作用。
图1： 外源性细胞外囊泡的标记策略。
图片来源：Boudna A.、Campos AD. 等。等人， https://doi.org/10.1186/s12964-024-01548-3
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用于EV染色的荧光染料：当前方法和局限性
检测和描述小型电动汽车在该领域提出了重大挑战。 流式细胞术然而，由于其能够进行快速、高通量、多参数分析，因此经常被使用。各种荧光探针通常用于通过流式细胞术检测小型 EV，包括：
1. 基于抗体的EV染色
这些染料利用与小型 EV 上的表面标记物的特定相互作用，实现精确和有针对性的检测。这些染料与抗体结合，可识别并结合 EV 膜上的不同蛋白质，从而有助于识别和表征它们。值得注意的表面标记物包括四跨膜蛋白 CD9、CD63 和 CD81。这些蛋白质在 EV 表面高度富集，通常用作检测标记物。 抗体染料 针对这些四跨膜蛋白进行分析具有特异性和灵敏度，可以详细分析 EV 群体，包括其来源、组成和潜在功能。这种有针对性的方法提高了 EV 研究中流式细胞术的准确性，为了解其在各种生理和病理过程中的作用提供了宝贵的见解。
2. 膜通透性EV染料
膜渗透性染料，例如 羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯 (CFSE)在标记和追踪 EV 中起着关键作用。CFSE 是一种亲脂性荧光染料，可被动扩散到细胞中，当细胞内酯酶裂解其醋酸盐基团时，它会发出强荧光。该反应导致染料与细胞内蛋白质中的胺基共价结合，产生稳定而强烈的荧光信号。然而，抗原表达和细胞内蛋白质含量因细胞来源而异，导致小 EV 群体内的异质性。因此，CFSE 标记可能不是跨不同样本比较的最佳选择。此外，染料可能会从标记细胞中泄漏，染色周围环境并产生可能掩盖 EV 信号的背景噪声。
3. 亲脂性EV染色剂
各种各样 商业脂质染料 可用的染料包括PKH染料和碳菁染料（例如DiD、DiR、DiI）。PKH染料是高荧光细胞连接剂，可整合到细胞膜的脂质双层中。常见的例子包括PKH26（红色）和PKH67（绿色）。尽管PKH染料广泛用于标记小型EV，但越来越多的人认为它们不适用，因为它们会导致 显著聚集并改变囊泡大小，并且它们被细胞吸收会产生假阳性，从而损害实验结果的可靠性。研究表明，PKH染料可以与其他细胞成分非特异性结合或形成游离染料聚集体，从而产生背景噪音，并使标记EV的鉴定变得复杂。 PKH 染料 还可能影响膜-膜融合、膜蛋白的流动性、膜硬度和 EV 大小。
羰花青染料诸如 DiO 和 DiI 之类的亲脂性染料是另一类用于 EV 标记的亲脂性染料。这些染料以其明亮的荧光和与各种成像技术的兼容性而闻名。然而，这些染料的溶解性较差，导致聚集体和荧光胶束的形成，很容易被误认为是 EV。这不仅降低了标记的准确性，还会干扰流式细胞术和荧光纳米颗粒追踪分析 (fNTA)，从而产生误导性数据。
虽然亲脂性染料（如 PKH 和羰花青染料）是 EV 标记的宝贵工具，但它们的局限性需要仔细考虑和实验设计。研究人员必须考虑潜在的非特异性结合、聚集体形成以及对膜特性的影响，以确保准确可靠的 EV 检测。探索替代染料和标记技术可能有助于缓解这些问题并提高 EV 研究的准确性。
ExoBrite™：针对电动汽车优化的下一代染料
保持囊泡的完整性，同时确保准确的荧光标记，对于可靠的分析至关重要。对于细胞外囊泡膜染色，现代专用染料，例如 Biotium的 ExoBrite™系列 通过提供专为囊泡囊泡研究设计的优化化学方法，克服了这些局限性。Biotium 凭借其突破性的膜染料彻底改变了囊泡囊泡标记技术，较传统方法有了显著的改进。
ExoBrite™ True EV 膜染料 – 最佳 Pan-EV 覆盖率
ExoBrite™ True EV 膜染料 代表了囊泡标记技术的突破，专门针对细胞外囊泡进行了优化。这些染料能够对样本中的囊泡提供更高、更接近完全的覆盖，从而确保高效标记并最大程度地减少聚集。
与 PKH、DiO、DiI 和 DiD 等传统染料不同，这些染料通常会形成聚集体、扭曲囊泡大小并产生假阳性，而 ExoBrite 染料则可以 明亮、特定的信号 可以与非特异性颗粒清晰地区分。至关重要的是，它们的设计旨在解决聚集问题，从而能够在流式细胞术检测和其他分析工作流程中清晰且可重复地将EV与背景区分开来。 fNTA 分析表明，ExoBrite™ True EV 膜染色剂可检测到样本中约 96% 的所有 EV，而 PKH 的检测率仅为约 32%。
它们与抗体共染色完全兼容，使研究人员能够将膜染色与表面标志物表型分析相结合，从而获得更深入的生物学见解。对于严格的工作流程，ExoBrite 也符合 EV 方法学的最佳实践。当与仅染料样品和去垢剂裂解试验等对照一起使用时，研究人员可以确认荧光源自脂质结合的 EV，而不是游离染料胶束或污染物。
客户评价 – NTU 研究员
ExoBrite 能高效染色胞外囊泡膜，并提供清晰的可视化效果。在 SEC 柱纯化后，效果尤其出色，确保分离的胞外囊泡能够被检测到。即使只有 1 µL 的染色剂，信号也清晰可靠。
这使得 ExoBrite 染色对于流式细胞术、fNTA 和高级成像具有高度可靠性，可提供可重复的、出版质量的 EV 分析并提高 EV 研究的精度。
ExoBrite™ EV 表面染色剂s
Biotium 的 ExoBrite™ EV 表面染料通过结合特定的 EV 膜表面，提供了一种靶向标记细胞外囊泡的方法。每种染料都根据不同的生物学问题提供独特的优势：
| 产品 | 目标电动汽车膜表面 | 千浔新材 | 最适合 |
|---|---|---|---|
| ExoBrite™ CTB EV 染料 | 脂筏中的GM1神经节苷脂 | 聚集最少；对纯化或珠结合的 EV 有效 | 标记 GM1 阳性 EV 亚群； 超分辨率成像 （ExoBrite™ STORM CTB 用于 STORM 显微镜） |
| ExoBrite™ Annexin V EV 染料 | 磷脂酰丝氨酸（PS）暴露于EV和凋亡细胞膜上 | 可靠检测 PS 阳性亚群；与传统染料相比，聚集减少 | 识别 PS 阳性 EV 群体 |
| ExoBrite™ WGA EV 染色剂 | EV表面的N-乙酰葡萄糖胺和唾液酸残基 | 明亮的信号；与多种 EV 源具有广泛的兼容性；适用于纯化或珠结合 EV | 糖基化EV亚群的一般标记 |
这些表面靶向特异性EV染料能够选择性标记与生物相关的EV膜生物标志物，从而扩展了研究人员的分析工具包。与传统染料相比，ExoBrite™ EV表面染料最大限度地减少了聚集，为纯化和珠结合的EV提供清晰独特的信号。这项先进技术支持EV亚群的准确识别和表征，为研究人员提供可重复的高分辨率数据，并为EV生物学和生物医学研究开辟新的机遇。
ExoBrite™ STORM CTB EV 染色剂，用于超分辨率成像
对于寻求高级成像能力的研究人员来说， ExoBrite™ STORM CTB EV 染色剂 提供无与伦比的性能。这些特殊的 CTB 荧光结合物可特异性结合脂质筏和 EV 表面的 GM1 神经节苷脂，从而实现高分辨率 STORM 成像。结合 STORM 验证的 CF® 染料，这些染料即使在最苛刻的成像条件下也能提供出色的清晰度和灵敏度。与传统的亲脂性染料不同，ExoBrite™ STORM CTB EV 染料表现出最小的背景聚集，确保以前所未有的精度精确识别和分析 EV。
Biotium 推出的 ExoBrite™ 等创新染料代表着 EV 标记和成像技术的重大飞跃。通过克服 PKH 和羰花青等传统染料的局限性，这些进步为研究人员提供了研究 EV 生物学的可靠而精确的工具。这些突破性的技术不仅增强了我们对 EV 的了解，而且在医学研究中的应用前景广阔。
CD9、CD63、CD81抗体偶联物
Biotium的 ExoBrite™抗体偶联物 旨在为研究人员提供高度特异性的工具，用于检测典型的EV膜生物标志物。这些试剂靶向四跨膜蛋白CD9、CD63和CD81，这些是EV识别和表征中最广泛认可的标志物。ExoBrite抗体采用优化配方，可提供更明亮的信号、更少的聚集和更优异的信噪比，使其在多种EV分析平台上都具有可靠性。
| 产品 | 目标/标记 | 应用领域 | 主要优势 |
|---|---|---|---|
| ExoBrite™ Flow抗体偶联物 | CD9, CD63, CD81 | 分离EV的流式细胞术 | 经验证，可实现稳健检测；采用专有缓冲液配制，可减少抗体聚集；EV 染色更明亮，信噪比最佳；可作为 单色鸡尾酒 （广泛覆盖）和 三色鸡尾酒 （多重表型分析） |
| ExoBrite™ 西方抗体 | CD9, CD63, CD81 （阳性标记）； 钙联蛋白 （阴性标记） | EV提取物的Western印迹分析 | 与 HRP 或近红外染料结合，实现高信噪比；包含 Calnexin 抗体，通过排除细胞污染来确认 EV 制备的纯度 |
| ExoBrite™ STORM 抗体 | CD9, CD63, CD81 | 超分辨率成像（dSTORM） | 与经 STORM 验证的 CF® 染料结合，实现高分辨率 EV 可视化 |
这些基于抗体的工具确保 特异性高，背景极小，从而能够通过流式细胞术、蛋白质印迹法和超分辨率显微镜工作流程准确表征 EV 群体。
可靠电动汽车标签的最佳实践
为了确保可靠且达到出版质量的 EV 数据，研究人员应在染色工作流程中采用严格的控制和纯化方法：
- 使用仅染料对照：检测并解释游离染料聚集体的背景荧光。
- 应用去垢剂裂解对照：确认荧光信号来自脂质结合的 EV，而不是污染物。
- 染色前纯化EV：血浆等生物体液中含有的脂蛋白数量远远超过EV，并且也能被亲脂性染料染色。适当的纯化（例如， 尺寸排阻色谱) 在染色之前进行纯化对于去除这些污染物和提高标记特异性至关重要。
- 进行染色后清理：标记后，额外的清理步骤，例如 SEC专栏 或者可以使用旋转过滤器去除未结合的染料并降低背景噪音。
- 平衡敏感性和特异性：Pan-EV 膜染色剂具有广泛的覆盖范围，而表面靶向染色剂或抗体偶联物可以对 EV 亚群进行精确分析。
通过将这些最佳实践与 ExoBrite™ 等优化试剂相结合，研究人员可以实现 技术严谨性 以及 生物学准确性，确保下游 EV 分析的信心。
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结论：提高电动汽车研究的标准
可靠的胞外囊泡标记对于准确的检测和表征至关重要。PKH 和羰花青等传统染料由于存在伪影和误导性信号而越来越不被推荐，而专用化学试剂如今可在流式细胞术、fNTA、蛋白质印迹和超分辨率成像等技术中提供可重复的高分辨率结果。在这些创新中，Biotium 的 ExoBrite™ 系列提供了优化的染料和抗体偶联物，符合最佳实践，使研究人员能够生成值得信赖的数据。
为了亲自探索这些创新， r每个人都前往亚特兰蒂斯生物科学公司 了解 Biotium 的最新促销活动和产品样品。
参考文献：
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