CRISPR-Cas9基因編輯 徹底改變了生物醫學研究，為修改 DNA 提供了前所未有的精確度。然而，將 CRISPR 組件有效且安全地遞送到目標細胞中仍然是一個主要障礙。 腺相關病毒（AAV） 由於其安全性、組織特異性和長期基因表達，已成為領先的運載工具。

什麼是 CRISPR-Cas9？它是如何運作的？

CRISPR-Cas9 是突破性的基因編輯工具，最初源自於細菌中的天然免疫防禦系統。它徹底改變了基因工程，因為它 精確, 效率以及 多功能性.

CRISPR-Cas9 是一個雙組分系統：

• Cas9核酸酶： 這是在基因組特定位置切割雙股 DNA 的分子「剪刀」。一旦 DNA 被切割，細胞的天然修復機制就會被活化。這些修復途徑主要 非同源末端連接 (NHEJ) or 同源定向修復 (HDR)，可以用來破壞基因或引入精確的基因改變。
• 嚮導RNA（gRNA）： 這是一種短的合成 RNA 分子，可將 Cas9 引導至精確的目標序列。它透過與 DNA 形成互補鹼基對來實現這一點，確保在正確的位置進行切割。除了匹配目標 DNA 之外，成功的結合和切割還需要附近的 PAM（原型間隔區相鄰基序） 序列 — 例如， 5′-NGG-3′ 對於 SpCas9。 PAM 對於 Cas9 識別和切割 DNA 至關重要。

DNA 被切割後會發生什麼事？

Cas9 切割 DNA 後，細胞會將斷裂檢測為損傷並迅速激活其自然修復系統。修復途徑的選擇決定了DNA是簡單地修補錯誤還是精確地重寫，這對於基因組編輯的結果至關重要。

1.非同源末端連接（NHEJ）

• 這是細胞的快速修復方法。
• 它直接將斷裂的 DNA 末端連接在一起，但 容易出錯，往往導緻小 插入或刪除（indel）.
• 用例： 這些隨機變化可能會破壞基因功能——非常適合 基因敲除實驗.

2. 同源性定向修復（HDR）

• 這是一種更精確但效率較低的途徑。
• 該單元使用 修復模板 （可由研究人員提供） 插入或更正 斷裂位點的特定DNA序列。
• 用例： 小胸女性的 基因修正 or 敲入 策略，例如引入治療基因變體。

為什麼 AAV 是 CRISPR 基因傳遞的主要載體

將 CRISPR 組件有效地遞送到細胞中對於成功進行基因組編輯至關重要。在眾多運送方法中，AAV 已成為一種流行的選擇。

AAV 非常適合 CRISPR 遞送，因為它們：

• 感染分裂細胞和非分裂細胞：
  AAV 可以有效進入多種類型的細胞，包括非分裂細胞，如神經元、肌纖維和肝細胞。這 廣向性 對於瞄準那些難以編輯的組織來說至關重要。

• 與腺病毒或慢病毒相比，免疫原性較低：
  AAV 通常對免疫系統具有良好的耐受性，從而導致 降低嚴重免疫反應的風險。這使得它們更安全 体内 應用，特別是長期或重複治療。

• 提供長期表達：
  一旦遞送，AAV 基因組主要以附加體（非整合 DNA）的形式存在於細胞核中，從而允許 穩定、持續的表達 對 CRISPR 組件進行數月甚至數年的修復——這對於需要持續基因改造的疾病來說非常重要。

• 提供一系列具有不同組織靶向性（趨向性）的血清型：
  不同的 AAV 血清型自然偏好不同的組織（例如，AAV9 針對心臟和肌肉，AAV8 針對肝臟，AAV2 針對視網膜）。研究人員可以選擇或設計特定的血清型來提高傳遞效率並最大限度地減少脫靶效應。

將 CRISPR 包裝到 AAV 中

雖然 AAV 是 CRISPR 遞送的高效載體，但它們的載貨能力相對較小，約為 4.7 千鹼基（kb）。 這使得將 Cas9 蛋白和 sgRNA 裝入單一 AAV 變得頗具挑戰性。例如， SpCas9 （從 化膿性鏈球菌)，即第一個被廣泛使用的 Cas9 酶，相對較大（~4.2 kb），幾乎沒有空間容納必需的調控元件和引導 RNA。一種更小、與 AAV 更相容的 Cas9 酶， SaCas9 （從 金黃色葡萄球菌)，後來被認為是一種有前途的替代方案，由於其尺寸較小（~3.2 kb），具有更容易包裝到 AAV 載體中的優勢。

為了克服 AAV 的尺寸限制，已經開發出幾種創新策略和方法：

突破尺寸限制的交付策略與創新

• 單一 AAV 系統：
  這種方法涉及將 Cas9 蛋白（例如 SaCas9）和 gRNA 包裝到單一 AAV 載體中。這是一種簡單、有效率的方法，非常適合小型基因組編輯。然而，它受到 AAV 貨物大小的限制，因此僅適用於 SaCas9 等較小的 Cas9 變體。該系統適用於簡單的基因敲除實驗或有針對性的突變，其中較小的編輯就足夠了。
• Mini-Cas蛋白：
  最有前景的創新之一是使用微型 Cas 蛋白，例如 Cas12f（~1.5 kb）。與傳統的 Cas9 酶相比，這些較小的 Cas 蛋白的尺寸顯著減小，因此可以輕鬆包裝到單一 AAV 載體中，而無需分裂。 Mini-Cas 蛋白維持了基因組編輯功能，同時克服了 AAV 包裝的尺寸限制，使其成為更廣泛應用的理想選擇，包括那些需要小而精確的基因組修改的應用。
• 分裂Cas9：
  此策略涉及將 Cas9 蛋白（例如 SpCas9）分成兩部分，每部分包裝到單獨的 AAV 載體中。這些載體同時遞送至目標細胞，Cas9 組件在那裡重新組裝並進行基因組編輯。該系統支援使用更大的 Cas9 蛋白，例如 SpCas9，可用於更複雜的編輯。然而，這種分離式 AAV 系統也存在一些缺點，包括效率較低（因為兩個載體必須共同感染同一個細胞）以及協調遞送的複雜性增加。
• 雙AAV：
  解決包裝難題的另一個方法是使用雙 AAV 系統，其中 Cas9 蛋白及其相應的 gRNA 被包裝到單獨的 AAV 載體中。與分裂系統類似，這些載體被共同遞送至目標細胞，在那裡各組分組裝並執行所需的基因編輯。此方法透過將組件分佈在多個載體上，有效地克服了 AAV 貨物尺寸的限制。它還允許使用更大的 Cas9 蛋白，同時保持傳遞必要調節元件的能力。與分裂系統類似，此方法需要仔細協調以確保兩個 AAV 載體有效感染同一個細胞。

• 規模較小的推廣者
  使用較小的啟動子來驅動 Cas9 和 sgRNA 的表達可以釋放 AAV 有效載荷中的空間，從而允許納入其他必要元素。例如，可以使用工程啟動子來實現高表達水平，同時保持緊湊的尺寸。 

AAV-CRISPR 遞送的關鍵工具和技術

AAV 是 CRISPR 傳遞的廣泛選擇，因為它們能夠有效傳導多種細胞類型，同時保持低免疫原性。然而，優化 AAV 傳遞需要幾個關鍵工具和策略來確保有針對性和有效的基因組編輯。這些策略專注於增強組織特異性表達、gRNA 設計、修復模板傳遞和對 Cas9 活性的時間控制。

1. 組織特異性表現的啟動子： 啟動子對於控制 CRISPR 成分（例如 Cas9 和 gRNA）在目標生物體內表現的位置和時間至關重要。不同的啟動子可以實現組織特異性表達，最大限度地減少脫靶效應並提高基因編輯的精確度。常見的啟動子類型包括：
   • 無所不在的推動者： 諸如 CAG 和 EF1α 之類的範例能夠在多種細胞類型中廣泛表達，使其適用於一般的基因編輯應用。
   • 肝臟特異性啟動子： TBG 和 ApoE 專門針對肝臟，這對於基於肝臟的基因治療和減少其他組織中不必要的表達至關重要。
   • 神經元啟動子： 突觸蛋白和 CaMKIIα 啟動子專門驅動神經組織中的表達，從而實現大腦和神經系統中的目標基因編輯。
   • 肌肉特異性啟動子： MHCK7 和 Desmin 等啟動子旨在針對肌肉細胞，這對於與肌肉疾病相關的應用非常重要。
2. gRNA設計與表現： gRNA 將 Cas9 蛋白引導至正確的基因組位置，因此其設計對於 CRISPR 介導的基因組編輯的精確度至關重要。 gRNA表達的關鍵面向包括：
   • Pol III 啟動子（U6 或 H1）： 這些啟動子用於驅動 gRNA 的表達，確保它們透過 RNA 聚合酶 III 轉錄為小 RNA。 U6 和 H1 啟動子通常用於 CRISPR 實驗中，以維持高 gRNA 表現水平，以實現高效的基因組編輯。
   • 多重 gRNA： 如果需要同時編輯多個基因，則使用多重 gRNA。如果 AAV 載體內的空間允許，則可以將多個 gRNA 打包到單一 AAV 中，從而實現一次遞送中多個目標的編輯。這對於複雜的基因編輯任務特別有用，例如全基因組篩選或多基因治療應用。
3. 同源性定向修復（HDR）的修復模板： HDR 是進行點突變或更大插入等精確基因編輯的首選途徑。為了促進 HDR，供體 DNA 模板與 CRISPR 組件共同傳遞，從而允許將所需的基因變化整合到基因組中。要點包括：
   • 捐贈者範本的共同遞送： 為匹配基因變化而設計的供體模板要么包裝在同一個 AAV 中，要么包裝在單獨的載體中。此範本有助於透過 HDR 通路整合所需的編輯。
   • 雙AAV HDR策略： 對於更大的基因編輯，雙 AAV 系統通常是必要的。這些策略經過最佳化，可提高 HDR 效率，尤其是在處理超過單一 AAV 載貨能力的較大基因構建體或複雜修復模板時。
4. 可調控系統： 控制遞送後 CRISPR 成分的表達可以透過最大限度地減少脫靶效應和減少不必要的免疫反應來顯著提高安全性和有效性。一些關鍵的可監管系統包括：
   • 藥物誘導的Cas9系統： 這些系統允許透過施用特定藥物（例如四環素或強力黴素）來控制 Cas9 表現。這使得時間調節成為可能，確保 Cas9 僅在需要時才活躍，這對於需要精確控制基因編輯活動的應用至關重要。
   • 自滅活系統： 這些系統旨在限制 Cas9 表達的持續時間，從而降低脫靶效應的風險。 Cas9 活性是暫時的，一旦編輯過程完成，系統就會“自我失活”，確保基因編輯過程不會持續超過所需的時間範圍，從而增強該方法的整體安全性。

總之，這些工具和策略為 AAV-CRISPR 傳遞提供了關鍵的增強，確保基因編輯過程對於各種治療應用既有效又安全。

項目類別	關鍵工具/元素	標註/優點
發起人	• 普遍存在：CAG、EF1α • 肝臟特異性：TBG、ApoE • 神經元：突觸蛋白、CaMKIIα • 肌肉特異性：MHCK7、Desmin	組織特異性表現；減少脫靶活性
gRNA設計	• U6、H1啟動子（Pol III） • 多重 gRNA	高效定位；支持複雜的基因組編輯
修復模板	• 供體 DNA 共遞送 • 雙AAV HDR策略	精確編輯（例如點突變或插入）
可調控系統	• 藥物誘導型 Cas9（例如 Tet/Dox） • 自失活 Cas9 系統	時間控制；降低脫靶和免疫風險

使用 AAV-CRISPR 進行體內基因編輯：方法和實際案例

在體內 基因組編輯涉及將 CRISPR 組件直接遞送到生物體中，從而實現系統性或組織特異性的修改，而無需 離體 細胞操作。 AAV 尤其 非常適合這種方法 因為它們能夠有效地針對特定組織。

• 直接治療應用： 在體內 編輯消除了細胞提取和再輸注的需要，簡化了流程並降低了相關風險。
• 廣泛的組織標靶： AAV 能夠將 CRISPR 組件同時遞送至多個器官（例如肝臟、肌肉、中樞神經系統），從而提供廣泛的治療可能性。
• 永久或持久的影響： AAV 提供持續表達，確保單次治療即可獲得長期治療效果。
• 非侵入性且經濟高效： 在體內 編輯減少了對複雜、昂貴的程序的需求，例如 離體 細胞操作，簡化治療過程並降低整體成本。
• 降低免疫反應的風險： 在體內 基因編輯降低了免疫排斥的可能性，因為編輯過的細胞仍留在體內，避免了與重新引入外部修改的細胞有關的併發症。

示例 體內 AAV-CRISPR編輯

1. 肝臟標靶編輯

• 家族性高膽固醇血症（FH）
  • 方法：AAV8 攜帶 CRISPR-Cas9 來破壞 PCSK9 （LDL 膽固醇的調節劑）。
  • 結果：小鼠和非人靈長類動物（NHP）的 PCSK50 水平降低約 9%，導致 LDL 膽固醇降低。
  • 臨床相關性：FH 患者的潛在一次性治療。

2. 神經和眼部疾病

• 亨廷頓舞蹈症 (HD)
  • 方法：AAV-CRISPR-Cas9 破壞突變體 熱電偶 在紋狀體神經元。
  • 結果：減少突變 HTT 聚集體並改善小鼠模型中的運動功能。
• 萊伯先天性黑蒙症 10（LCA10）
  • 方法：AAV5 攜帶 CRISPR-Cas9 去除致病 CEP290 內含子突變。
  • 結果：動物模型視力部分恢復。
  • 臨床試驗：EDIT-101（Editas Medicine）－首次針對 LCA10 的人體 AAV-CRISPR 試驗。

3. 肌肉定向編輯

• 杜氏肌肉營養不良症 (DMD)
  • 方法：AAV9-CRISPR 切除外顯子 51 DMD的 基因恢復肌肉營養不良蛋白閱讀框架。
  • 結果：小鼠、狗和 NHP 中的功能性肌肉營養不良蛋白恢復。

4. 心血管疾病

• 肥厚性心肌病 (HCM)

• 方法：AAV9-CRISPR 破壞突變體 MYBPC3 在心肌細胞中。
• 結果：小鼠的心臟功能得到改善。

CRISPR-AAV 療法的當前挑戰和未來方向

儘管 体内 AAV-CRISPR 基因編輯仍存在一些技術和轉化挑戰。克服這些障礙對於充分發揮基因組編輯對多種疾病的治療潛力至關重要。持續創新 向量設計、編輯技術和製造流程正在塑造該領域的未來方向，旨在提高臨床應用的安全性、有效性和可及性。

1.免疫反應

• 挑戰： 由於先前接觸過病毒，許多人體內已經存在針對天然 AAV 血清型的中和抗體 (NAbs)。這些抗體可以阻止有效的 AAV 轉導，從而限制 CRISPR 基因編輯療法的有效性。
• 解決方案：
  • 衣殼工程： 開發能夠逃避現有免疫同時維持或改善組織特異性的新型 AAV 衣殼。
  • 免疫抑制策略： 正在探索在 AAV 給藥期間臨時使用免疫調節劑。
  • 血清型轉換： 如果有必要，可以施用不同的 AAV 血清型來重複給藥。

2. 脫靶效應

• 挑戰： CRISPR-Cas9 有時會在與目標序列相似的位點造成意外的雙股斷裂，進而有導致基因組不穩定、致癌或其他不良影響的風險。
• 解決方案：
  • 高保真Cas9變體： eSpCas9、HypaCas9 和 HiFi Cas9 等工程版本可減少脫靶編輯，同時維持較高的標靶活性。
  • 鹼基編輯和主要編輯： 這些新一代編輯器可以進行精確的核苷酸改變而不會造成雙股斷裂，大大降低了脫靶突變的風險。
  • 改進的 gRNA 設計演算法： 計算工具有助於優化 gRNA 序列的特異性。

3. 持久性與短暫性

• 挑戰： 永久性基因組改造非常有效，但如果出現意想不到的後果，可能會有風險。對於某些治療環境，最好進行短暫、可控制的編輯活動。
• 解決方案：
  • 誘導系統： 藥物可調節的 Cas9 系統（例如，強力黴素誘導的）允許定時控制 Cas9 活性。
  • 自失活系統： 包含自切割元素或自限制 Cas9 表達的設計可減少對編輯機制的長期暴露，從而增強安全性。
  • 臨時交付替代方案： 使用 mRNA 或蛋白質形式的 Cas9 而不是 DNA 載體來實現短暫但有效的編輯。

4.製造和可擴展性

• 挑戰： 臨床級 AAV 載體的大規模生產仍然成本高、耗時長且技術要求高。保持高滴度和純度（低空衣殼率）對於治療成功至關重要。
• 解決方案：
  • 改進的生產平台： 三重轉染系統、穩定生產細胞系和桿狀病毒系統正在進行最佳化，以實現更高的產量和可擴展性。
  • 連續淨化技術： 親和層析技術（例如 AVB Sepharose 管柱）等進步有助於更有效地純化 rAAV。
  • 自動化和封閉系統製造： 降低污染風險並提高大批次的一致性。

AAV 介導的 CRISPR 遞送是一種有效的策略 体内 基因組編輯，提供精確度、組織特異性和長期效果。雖然包裝限制和免疫反應等挑戰仍然存在，但微型編輯器、分裂系統和可調節 Cas9 的創新正在推動該領域的發展。

臨床試驗（例如 LCA101 的 EDIT-10）證明了 AAV-CRISPR 療法在現實世界中的潛力。隨著研究的進步，我們可以期待在直接治療患者遺傳疾病方面取得更多突破。

PackGene 的 AAV 和現成的 CRISPR/Cas9 rAAV 解決方案

PackGene生物技術 已成為 AAV 載體設計、製造和 CRISPR 相關治療開發的領導者。它們同時提供 客製化 AAV 服務 以及 即用型 CRISPR/Cas9 rAAV 產品 顯著加速 体内 基因編輯研究。

PackGene AAV 功能：

• 高產量製造： PackGene 使用專有技術平台（例如優化的細胞系和增強的 RC 和輔助質粒）來實現高純度和低空衣殼率的優異載體產量（高達 1E+16 GC）。
• 廣泛的血清型選擇： 包括天然血清型（如 AAV2、AAV8、AAV9）和針對組織特異性標靶的工程變體。
• 監理級生產： 符合 GMP 標準的製造支援從臨床前到臨床的應用。

現成的 CRISPR/Cas9 rAAV 產品：

• Cas9 在 EFS, 微型CMV, 巨細胞病毒，或各種 組織特異性啟動子.
• 有多種血清型可供選擇，包括 腺病毒2, 腺病毒8, 腺病毒9以及 AAV-PHP.eB.
• 有存貨 以及 一個工作天內即可出貨，非常適合快節奏或時間敏感的項目。
• 還提供 高保真Cas9 盡量減少脫靶效應，以及 CPF1 替代基因組編輯的版本。

準備好加速您的 CRISPR 研究了嗎？

PackGene 的現成 CRISPR/Cas9重組腺相關病毒 產品旨在提供高品質、可靠的結果，並具有快速的周轉時間，以確保您的專案順利推進。無論您需要廣泛表達還是組織特異性靶向，我們預製的 AAV 都可滿足您的體內基因組編輯需求。

了解我們 產品目錄 今天或 聯繫我們的團隊 討論我們如何幫助您實現下一次突破！

參考

1. Amoasii L、Hildyard JCW、Li H、Sanchez-Ortiz E、Mireault A、Caballero D、Harron R、Stathopoulou TR、Massey C、Shelton JM、Bassel-Duby R、Piercy RJ、Olson EN。基因編輯恢復了杜氏肌肉營養不良症犬模型中的肌肉營養不良蛋白表現。科學。 2018年5月362日;6410(86):91-XNUMX。 doi: 10.1126/science.aau1549。 Epub 2018 年 30 月 XNUMX 日。
2. Greer-Short，A.、Greenwood，A.、Leon，EC 等。 具有優化表達盒的 AAV9 介導的 MYBPC3 基因治療可增強 MYBPC3 心肌病變模型中的心臟功能和存活率。 Nat Commun 16，2196（2025）。 https://doi.org/10.1038/s41467-025-57481-7
3. Lau CH, Suh Y. 在體內 使用 AAV-CRISPR 系統對動物進行基因組編輯：應用於人類疾病的轉化研究。 F1000Res。 2017 年 20 月 6 日；2153：XNUMX。 doi: 10.12688/f1000research.11243.1.
4. Maeder ML、Stefanidakis M、Wilson CJ、Baral R、Barrera LA、Bounoutas GS、Bumcrot D、Chao H、Ciulla DM、DaSilva JA、Dass A、Dhanapal V、Fennell TJ、Friedland AE、Giannoukos G、Gloskowski、Dhanapal V、Fennell TJ、Friedland AE、Giannoukos G、Gloskowski、Glucksskowski、GJorcoulcoal. JE、Joshi S、Marco E、Mepani R、Reyon D、Ta T、Tabbaa DG、Samuelsson SJ、Shen S、Skor MN、Stetkiewicz P、Wang T、Yudkoff C、Myer VE、Albright CF、Jiang H。開發基因編輯方法以恢復 Leber 先天性黑蒙 10 型視力喪失。 Nat Med。 2019年25月；2(229):233-XNUMX。 doi: 10.1038/s41591-018-0327-9。電子版 2019 年 21 月 XNUMX 日。
5. Nelson CE、Hakim CH、Ousterout DG、Thakore PI、Moreb EA、Castellanos Rivera RM、Madhavan S、Pan X、Ran FA、Yan WX、Asokan A、Zhang F、Duan D、Gersbach CA。體內基因組編輯改善了杜氏肌肉營養不良症小鼠模型的肌肉功能。科學。 2016 年 22 月 351 日；6271(403):7-XNUMX。 doi: 10.1126/science.aad5143。電子版 2015 年 31 月 XNUMX 日。
6. Rothgangl T、Dennis MK、Lin PJC、Oka R、Witzigmann D、Villiger L、Qi W、Hruzova M、Kissling L、Lenggenhager D、Borrelli C、Egli S、Frey N、Bakker N、Walkers JA 2nd、Kadina AP、Victorov DV、Paceer Moor、KWeier、Mus D、Stoffel M、van Boxtel R、Holden K、Pardi N、Thöny B、Häberle J、Tam YK、Semple SC、Schwank G。獼猴體內 PCSK9 的體內腺嘌呤鹼基編輯可降低 LDL 膽固醇水平。國家生物技術。 2021年39月；8(949):957-XNUMX。 doi: 10.1038/s41587-021-00933-4。 Epub 2021 年 19 月 XNUMX 日。
7. Sconocchia T、Foßelteder J、Köhnke T、Majeti R、Reinisch A. 在人類造血幹細胞和祖細胞中設計致癌雜合功能獲得突變。 J Vis Exp. 2023年10月193日；(XNUMX)。 doi: 10.3791/64558.
8. 王 D、張 F、高 G。基於 CRISPR 的治療性基因組編輯：策略和透過 AAV 載體進行體內遞送。細胞。 2020年2月181日；1(136):150-XNUMX。 doi: 10.1016 / j.cell.2020.03.023.
9. 辛成，尹俊，袁S. 等。 對微型 CRISPR-Cas12f 核酸酶進行基因破壞的全面評估。 Nat Commun 13，5623（2022）。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-33346-1
10. 楊S，常R，楊H，趙T，洪Y，孔賀，孫X，秦Z，金平，李S，李XJ。 CRISPR/Cas9 介導的基因編輯可改善亨廷頓舞蹈症小鼠模型的神經毒性。 J Clin Invest。 2017 年 30 月 127 日；7(2719):2724-XNUMX。 doi: 10.1172 / JCI92087。 Epub 2017年19月XNUMX日