顯微鏡是我們觀察無形世界的眼睛，揭示了生命和物質的複雜細節。從最小的微生物到複雜的材料結構，顯微鏡開啟了我們曾經無法掌握的知識領域。

圖1： 肉眼、光學顯微鏡和電子顯微鏡的分辨能力。 

資源： 科學學習中心

顯微鏡之旅始於 16 世紀末，當時 撒迦利亞詹森荷蘭眼鏡製造商被譽為創造了第一台複合顯微鏡。這項突破性的發明為當今可用的各種技術奠定了基礎。這些技術根據所使用的光類型、影像形成方式以及它們所服務的特定應用而有很大差異。 

在這次探索中，我們將深入研究顯微鏡技術的迷人世界，揭示其基本原理、功能和限制。透過了解不同方法的優點和缺點，研究人員可以選擇最佳技術來解開隱藏在樣本中的秘密。 

1. 明場顯微鏡

圖2： 明場顯微鏡光學裝置（左）。有絲分裂不同階段的洋蔥細胞的明場影像（右）。

來源： 顯微鏡俱樂部; 維基共享資源 

明場顯微鏡是顯微鏡中的一項基本技術，因其簡單性和可靠性而被廣泛應用。作為生物學和醫學中最常見的方法之一，它可以對各種樣本進行詳細觀察。

明場顯微鏡如何運作？

明場顯微鏡採用基本的光學系統，其中光線由聚光鏡收集，穿過樣本並進入物鏡。所形成的影像是由於樣本吸收、反射和折射光而引起的光強度變化而形成的。這種對比機制會在明亮的背景下產生深色樣本，因此得名。明場顯微鏡對於具有足夠對比的薄、半透明標本最有效。這種對比度可以是樣品固有的，例如天然色素沉著，也可以透過染色技術人為增強。 

明場顯微鏡的應用

明場顯微鏡的多功能性延伸到許多領域。生物學家和醫學科學家利用這種技術來檢查細胞、組織和微生物。材料科學家也使用明場顯微鏡來分析材料的結構。

明場顯微鏡的局限性

雖然明場顯微鏡對於具有足夠對比度的樣品有效，但它受到透明樣品的挑戰。該技術可視化細節的能力受到樣本與其背景之間的對比度的限制。

2. 暗視野顯微鏡

圖3： 暗視野顯微鏡光學裝置（左）。暗場影像 杜鵑 （正確的）。 

來源： 顯微鏡俱樂部; 維基共享資源

與明場顯微鏡相比，暗場顯微鏡透過阻擋直射光到達物鏡來產生引人注目的影像。只有樣本本身散射的光才能進入鏡頭，從而在黑暗的背景下形成明亮的樣本。

暗視野顯微鏡如何運作？

暗視野顯微鏡透過阻擋直射光到達樣本來實現高對比度。使用特殊的聚光鏡，光線從側面照射到樣品上，形成空心錐體照明。當存在樣本時，它會散射光線，使其進入物鏡。這會在深色背景下產生明亮的樣本影像，從而增強可視性，特別是對於未染色和透明的樣本。

暗視野顯微鏡的應用

暗視野顯微鏡對於觀察活的、未染色的標本特別有用，例如細菌、原生動物和螺旋體。它也用於材料科學中檢測小顆粒和缺陷。它對於突出顯示不透明樣品中的表面結構、缺陷和邊界非常有效。

暗視野顯微鏡的局限性

黑暗的背景可能會使觀察樣本內的精細細節變得困難，而灰塵和碎片可能會顯示為明亮的物體，可能會模糊樣本。此外，暗場所需的高光強度可能會損壞敏感樣本。

3. 相差顯微鏡

相差顯微鏡是一種強大的技術，用於可視化透明樣本（例如活細胞），而明場顯微鏡缺乏足夠的對比。它利用了這樣一個事實：樣本內的不同結構具有不同的折射率，導致光以不同的速度穿過它們。

相差顯微鏡如何運作？

使用特殊的聚光鏡和物鏡將相位差（人眼看不見）轉換為振幅差（可見的亮度變化）。這增強了樣本的對比度，而無需染色。

相差顯微鏡的應用

相差顯微鏡廣泛應用於細胞生物學中，用於研究活細胞、觀察細胞內結構和監測動態過程。它也用於微生物學中檢查細菌和其他微生物。

相差顯微鏡的局限性

相差影像通常會在結構邊緣周圍出現光暈偽影，這可能會模糊細節。與明場顯微鏡相比，物鏡中的相位環會稍微降低整體解析度。由於需要專門的相襯物鏡和聚光鏡，與標準明場光學元件相比，它的成本也更高。

圖4： 明場（左）和相差（右）的人類神經膠質細胞影像。  

來源： 顯微鏡U

4. 微分乾涉 (DIC) 顯微鏡

圖5： 人類頰黏膜上皮細胞（a、b）、鼠腎組織厚切片（c、d）和 Obelia 息肉狀環狀莖的 DIC（a、c、e）和相差（b、d、f）影像週弧 

來源：  奧林巴斯生命科學公司 

微分乾涉對比 (DIC) 顯微鏡，也稱為諾馬斯基干涉對比，是一種複雜的技術，可以產生引人注目的、幾乎類似 3D 的透明樣本影像。它擅長揭示樣品內折射率的細微變化。

DIC 顯微鏡如何運作？

DIC 採用偏振光和一系列光學元件來產生兩束稍微偏移的穿過樣本的光束。由於樣本折射率的變化而導致這些光束之間光路長度的差異，從而產生產生影像的干涉圖案。

DIC 顯微鏡的應用

DIC 對於研究未染色的生物樣本特別有用，例如活細胞、胚胎和微生物。該技術在材料科學中對於檢查透明或半透明材料也很有價值。

DIC 顯微鏡的局限性

DIC 顯微鏡最適合具有細微折射率變化的薄而透明的樣品。對於較厚的標本（例如組織切片或具有強烈色素沉著的標本），其有效性會顯著降低。由於 DIC 需要專門的光學元件，因此增加了顯微鏡系統的整體成本。

5. 寬場熒光顯微鏡

寬場螢光顯微鏡是一種以激發光照射整個樣本以可視化螢光標記結構的基本技術。

寬場熒光顯微鏡 作品？

當螢光團吸收特定波長的光（激發）並發射較長波長的光時，就會產生螢光。為了使目標分子可視化，使用螢光團綴合探針（例如抗體或核酸探針）來特異性標記感興趣的成分。然後用激發光照射樣品，發射的螢光由物鏡收集。濾光片選擇性地傳輸發射的光，同時阻擋激發光，產生螢光結構在黑暗背景下顯得明亮的影像。 

中的應用 寬場熒光顯微鏡

寬場螢光顯微鏡廣泛應用於生物研究中，透過免疫螢光染色來檢測和定位特定蛋白質。它也用於原位雜交以研究基因表現模式，以及細胞成像以可視化細胞結構和動力學。

局限性 寬場熒光顯微鏡

寬場螢光顯微鏡雖然用途廣泛，但也有一些限制。從焦平面上方和下方區域發出的光會產生背景噪聲，降低影像清晰度和對比度，尤其是在厚樣品中。長時間暴露在激發光下會損壞光敏樣品。螢光團濃度低會導致螢光訊號較弱。

6. 共焦顯微鏡

圖7： 以DAPI（核DNA-藍色）、Alexa 3-鬼筆環肽（肌動蛋白絲菌株-綠色）和標記的上皮細胞的寬視野顯微鏡（a、c 和e）和共聚焦顯微鏡（b、d和f）的488D 影像MitoTracker Red（粒線體-紅色）（a、b），∼20 μm 厚的小鼠腎臟切片，用DAPI（核DNA-藍色）、Alexa 488-小麥胚芽凝集素（膜染色-綠色）和Alexa 568- 標記鬼筆環肽（肌動蛋白絲染色紅色）（c，d），以及約3 μm 厚的MCF-10A 乳腺上皮細胞球體的50D 培養物，用核綠色螢光蛋白融合物和標記細胞膜的紅色螢光蛋白融合物標記（e ，f）。

資料來源： doi： 10.7171/jbt.15-2602-003 

共焦顯微鏡是一種強大的技術，可透過顯著提高影像解析度和對比度來克服寬場螢光顯微鏡的限制。

共焦顯微鏡如何運作？

共焦顯微鏡使用雷射逐點掃描樣品。偵測器前面放置了一個針孔孔徑，僅允許偵測從焦平面發出的光。這有效地消除了失焦光，從而產生更清晰的影像。 

共焦顯微鏡採用各種技術來實現高解析度成像： 

• 雷射掃描共焦顯微鏡 (LSCM)： 這是最常見的方法，它利用聚焦雷射光束逐點掃描樣品。雖然這種方法提供了卓越的影像質量，但它可能非常耗時，特別是對於大樣本或即時成像。 

• 轉盤共焦顯微鏡： 該技術利用具有多個針孔的旋轉盤同時照亮樣品的不同部分，從而加速影像擷取。因此，它通常是活細胞成像等動態過程的首選。 

• 可程式陣列顯微鏡 (PAM)： 與旋轉盤類似，它採用針孔圖案陣列，但在控制照明圖案方面具有更大的靈活性。然而，與其他兩種共焦顯微鏡相比，這種類型的共焦顯微鏡的應用不太廣泛。

共焦顯微鏡的應用

共焦顯微鏡廣泛應用於生物和生物醫學研究中，以研究細胞結構、蛋白質定位和動態過程。由於它能夠創建光學切片，因此對於組織和胚胎等厚樣本成像特別有價值。

共焦顯微鏡的局限性

雖然共焦顯微鏡比傳統的寬視野顯微鏡具有顯著的優勢，但它也有一些限制。由於共焦顯微鏡的點掃描性質，獲取影像可能很慢，特別是對於大型資料集或高解析度成像。共焦顯微鏡中使用的強雷射會損壞或漂白螢光樣品，限制觀察時間並影響資料品質。共焦顯微鏡的購買和維護費用昂貴，需要專門的設備和訓練有素的人員。 

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7. 多光子/雙光子顯微鏡

圖7： 共焦顯微鏡和雙光子激發顯微鏡的比較。 （右）螢光素染色的鯊魚脈絡叢影像。 共焦影像 (A) 的對比度在 70 µm 處顯著降低，而雙光子激發即使在 140 µm 處也能收集具有出色強度對比度的影像。 （左邊）  

資料來源： doi： 10.1371/期刊.pbio.0030207 

多光子顯微鏡或雙光子顯微鏡是一種先進的成像技術，超越了傳統共焦顯微鏡的功能。它可以實現更深的組織穿透並降低光毒性，使其成為研究生命系統的寶貴工具。

多光子顯微鏡如何運作？

多光子顯微鏡不使用單一光子激發螢光團，而是使用兩個或多個光子同時撞擊螢光團，使其發射更高能量的單一光子。由於激發光位於紅外光譜中，因此與共焦顯微鏡中使用的可見光相比，它可以更深入地穿透組織，從而能夠對更厚的樣品進行成像。由於激發光能量較低，樣品光損傷的風險顯著降低。

多光子顯微鏡的應用

多光子顯微鏡由於其獨特的特性，在對厚的活標本進行成像方面表現出色。由於其能夠更深入地滲透到組織中，因此適用於大腦結構、胚胎發育和器官生理學的非侵入性研究成像。由於其光毒性降低，它可以實現活細胞成像和動態細胞過程的長期觀察，而不會造成重大損害。它還提供了可能性 体内 影像來研究完整生物體的生物過程，例如疾病的動物模型。

多光子顯微鏡的局限性

所需的專業設備，包括高功率飛秒雷射和靈敏探測器，使得多光子顯微鏡成為昂貴的技術。雖然比共焦顯微鏡更深，但穿透深度仍受到組織內光散射和吸收的限制。並非所有螢光團都對雙光子激發有效，限制了標記試劑的選擇。

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8. 全內反射螢光 (TIRF) 顯微鏡

圖8： 落射螢光和 TIRF 照明的物理基礎 (A、B)。   

使用落射螢光和 TIRF 獲得的影像比較（C、D） 

來源 doi: 10.1242/jcs.056218

TIRF 顯微鏡是一種專門的螢光技術，可為細胞表面附近發生的成像過程提供卓越的靈敏度和空間解析度。

TIRF 顯微鏡如何運作？

當光在具有不同折射率的兩種介質（例如玻璃和水）之間的界面處發生全內反射時，會產生倏逝波。此波會短距離（通常為 100-200 nm）穿透到第二介質。只有漸逝場內的螢光團才會被激發，從而最大限度地減少來自本體溶液的背景螢光。這導致高信噪比。

TIRF 顯微鏡的應用

TIRF 在可視化膜動力學方面非常有用，例如受體-配體相互作用、囊泡和蛋白質運輸、內吞作用、病毒感染、細胞表面的細胞-基質相互作用或細胞骨架動力學。

TIRF 顯微鏡的局限性

TIRF 顯微鏡的一個缺點是必須使用貼壁培養細胞，限制了其在懸浮細胞或某些類型組織中的使用。

9. 超分辨顯微鏡

圖9： U2OS 細胞的活細胞 TauSTED 影像，使用肌動蛋白（SiR-肌動蛋白，發光）、微管（SPY555-微管蛋白，青色）和膜（與 WGA 偶聯的 CF488A，綠色）標記。 

資源： 徠卡顯微系統

超高解析度顯微鏡是超越傳統上限制光學顯微鏡解析度的衍射極限的一系列技術。這個突破性的領域徹底改變了我們對細胞和分子過程的理解。

超高解析度顯微鏡如何運作？

衍射極限是光的波動性所施加的物理約束，它將傳統光學顯微鏡的分辨率限制在大約 200 nm。超解析度技術採用各種策略來規避此限制，從而實現奈米級（5-20​​ nm）成像。一般來說，超解析度技術涉及樣本內螢光團的精確定位，以及計算重建以組合來自多個幀或測量的資訊以創建高解析度影像。透過操縱螢光團的發射特性或使用結構照明，這些技術繞過了光波長所施加的限制。

已經開發了幾種超解析度技術，每種技術都有其獨特的方法： 

• 受激發射損耗 (STED)： 採用第二個雷射將螢光發射限制在一個小區域，有效提高解析度。 

• 結構照明顯微鏡 (SIM)： 使用圖案照明產生增強影像細節的干涉圖案。 

• 光激活定位顯微鏡 (PALM) 隨機光學重建顯微鏡 (STORM)： 依靠單一螢光團的受控開關來精確確定它們的位置。

超高解析度顯微鏡如何運作？

超高解析度顯微鏡已在奈米尺度的廣泛領域中得到應用。這些包括研究細胞結構的組織和分子相互作用的動力學，對突觸和神經元網絡的精細結構進行成像，表徵奈米材料及其特性，以及研究疾病的分子基礎。

超高解析度顯微鏡的限制？

超高解析度顯微鏡雖然提供了前所未有的細節，但也面臨一些挑戰。隨著解析度的提高，技術要求和限制變得更加明顯。其中包括需要專門的螢光團、對振動等環境因素的敏感性以及潛在的光毒性。此外，超解析度系統複雜且昂貴，通常需要在設備和專業知識方面進行大量投資。平衡對更高解析度的渴望與實際考慮（例如樣品完整性和成本效益）對於成功的超解析度成像至關重要。

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參考文獻：  

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