一旦掌握了基礎知識（準備培養瓶、餵食細胞、匯合時傳代），細胞培養可能看起來很簡單，但真正的卓越之處在於細節。關鍵參數的微小偏差可能會為您的實驗帶來很大的不一致，從而導致意外的變化、細胞表型的喪失，甚至檢測失敗。

這不僅僅是關於技術：你使用的材料，例如你的基礎培養基（例如 記憶體, 轉速指數， 或者 的MEM) 和補充劑，例如 胎牛血清 (FBS)，在影響細胞行為中發揮關鍵作用。培養基成分、血清批次品質或培養條件的變化會顯著影響生長率、活力、形態和實驗可重複性。即使使用值得信賴的品牌，監控和優化您的文化環境仍然至關重要。

無論您研究的是原代細胞、間質幹細胞或永生化細胞系，了解並追蹤特定的培養指標都可以確保細胞健康、提高可重複性並增強實驗結果。

在本文中，我們將重點放在 七個關鍵數字 每個研究人員都應該監測並解釋為什麼它們對於獲得一致、高品質的結果很重要。

傳代數 反映出一個細胞群被 亞培養 （分裂並重新接種到新的容器中）自最初分離或從冷凍保存中恢復以來。每次傳代都標誌著一輪細胞擴增和繁殖。

雖然傳代次數通常被視為常規指標，但它在確定 細胞品質、性能和實驗可重複性。隨著時間的推移，細胞在 體外 文化。這些變化可能導致行為發生重大轉變，例如基因表現改變、增殖減慢、生存能力降低或不必要的分化——即使細胞形態保持不變。

為什麼我們需要監測和記錄細胞傳代次數？

監測和記錄通道數量可確保：

• 跨實驗的一致性：使用不同傳代次數的細胞可能會為您的數據帶來差異。
• 可預測的行為：細胞在定義的傳代窗口內表現得更一致。除此之外，它們可能還會出現老化或基因漂移的跡象。
• 合規性和可追溯性：在 GMP 工作流程或出版品質研究中，需要對細胞處理進行完全的可追溯性 - 其中包括傳代歷史。
• 做決定：了解傳代次數有助於研究人員決定何時創建新的工作庫存、丟棄老化的培養物或排除表型變化的故障。

未能追蹤通道數量可能導致 無法重複的結果, 誤導性結論和 浪費資源 — 尤其是在長期研究或臨床前開發過程。

什麼構成了一段話？

在常規細胞培養中，每次傳代培養或重新接種都算是傳代。

然而，一個常見的問題出現了：
解凍冷凍細胞算不算新的傳代？
答案是： 沒有 — 通道數應隨 重新播種，不 冷凍.

示例：
如果你有一個工作細胞系 第1段（P1），然後用胰蛋白酶消化並冷凍這些細胞，然後把小瓶標記為 P2。解凍後，它們仍然 P2 直到你再次對它們進行亞培養，此時它們就變成了 P3.

為什麼單靠傳代次數是不夠的

傳代數 不考慮分流比或接種密度因此對細胞實際分裂次數的了解有限。

考慮這個場景：

• 研究員 A 使用 10:1 的比例分割 P4 的培養物。
• 研究員 B 在 P10 時以 1:10 的比例分割相同的培養物。
• 兩人都將下一個燒瓶標示為 P11。

然而，1:10 分裂的細胞必須增殖更多才能達到匯合，這意味著它們會經歷 人口倍增（PD）更多。 隨著時間的推移，即使傳代次數相同，也會導致細胞在基因和功能上有所不同。

為什麼 PD 追蹤很重要

• 更準確： 反映真實的複製歷史，尤其是當分割率改變時。
• 告知老化閾值： 對於原代細胞和 MSCs 尤其重要，因為過度複製會導致其功能下降。
• 增強可比性： 在比較不同捐贈者、培養基配方或實驗室的結果時很有用。
• 支持轉化研究： 對於臨床級工作流程中的監管文件和可重複性至關重要。

監測 PD 與傳代次數、倍增時間可以 多維文化健康觀，從而能夠做出更好的決策，特別是在長期或轉化研究中。

2. 細胞接種密度

細胞接種密度 — 每單位面積（對於貼壁細胞）或每單位體積（對於懸浮細胞）接種的細胞數 — 是 基本參數 在細胞培養中。它直接影響生長速度、形態、基因表現和下游檢測的結果。

播種不正確可能導致：

• 過度匯合， 導致接觸抑制、訊號改變或早期衰老
• 低密度， 這可能會對細胞帶來壓力、延緩生長或改變行為
• 實驗變異性， 特別是在依賴細胞間相互作用、分泌因子或分化線索的檢測中

保持適當的播種密度可確保：

• 均勻的細胞分佈和附著（對於黏附細胞）
• 最佳營養和氧氣獲取
• 跨重複和時間點的一致性
• 維持關鍵細胞功能和表型

典型範圍

這些只是一般範圍。最佳密度會根據細胞類型、檢測類型、培養容器大小和實驗目標而變化。

專業貼士： 建議在解凍後立即接種比常規傳代期間更多的細胞，因為解凍後的細胞活力通常較低。

影響細胞接種密度的因素

細胞密度需求差異很大，取決於：

• 細胞類型 – 有些細胞（例如原代神經元或內皮細胞）需要緊密的細胞與細胞接觸才能生存，而其他細胞（例如纖維母細胞）則能夠耐受低密度接種。
• 應用– 增殖試驗需要較低的起始密度，而分化可能需要較高的初始匯合度。

查閱已發表的文獻並進行中試實驗以確定最適合您的特定係統的接種密度。適用於一個實驗室或細胞系的方法可能不適用於另一個實驗室或細胞系。

如何計算播種密度

以下是幫助您計算實驗正確接種密度的快速指南：

1. 確定所需的播種密度 — 例如，X 細胞/cm²
2. 計數你的細胞 使用血球計數器或自動計數器
3. 計算細胞總數 透過將 X 乘以容器的總表面積
4. 離心分離機 細胞懸浮液，並將沉澱物重新懸浮在較小的已知體積（例如 1 mL）中—將此體積稱為 Y
5. 計算體積 要達到所需播種密度需要使用：

示例： 您需要在 2 孔板中放置 10 × 6⁵ 細胞/孔。如果有 1 × 10⁶ 細胞/毫升，則每個孔需要 0.2 毫升。

3. 匯合率

細胞匯合度 指貼壁細胞覆蓋培養表面的百分比。它是細胞增殖和整體培養健康狀況的快速且重要的視覺指標。

匯合度不僅僅是一個常規指標，它還用於指導整個細胞培養工作流程的決策——從傳代和冷凍保存到實驗處理和分化。重要的是， 細胞行為, 基因表達和 對外界刺激的反應 都受到匯合水準的高度影響。

什麼是細胞匯合？

匯合度不是直接計數細胞，而是 表面覆蓋度的視覺評估。例如，70％匯合的燒瓶有70％的表面積被黏附細胞佔據。

如果使用得當，匯合度有助於確定：

• 何時分裂或傳代細胞
• 轉染或藥物治療的最佳時間
• 培養物是否適合分化、重編程或收穫等下游應用

過度整合的風險

未能在正確的時間傳球可能導致：

• 營養耗盡 代謝壓力
• 細胞進入 生長停滯、衰老或凋亡
• 積累 有毒細胞碎片 來自垂死細胞
• 形態和基因表現改變 歪曲事實 体内 條件
• 更高 污染風險，特別是真菌或細菌

為什麼準確的估算至關重要

儘管匯合度很重要，但通常仍透過顯微鏡下的肉眼來評估。這種「估計」是主觀的，並且可能因使用者而異——即使是同一個人在不同的日子。估計 60–90% 的匯合度（許多程序中最關鍵的範圍）特別容易出錯。

準確且一致地估計匯合支援：

• 重現性：確保細胞在整個實驗中處於相同的生理狀態
• 效率：避免因操作不當而導致試劑浪費和工作流程失敗
• 實驗有效性：確保轉染和藥物治療在最佳生長條件下進行

根據應用程式推薦的匯合度目標

更好地評估匯合度的專業技巧

• 使用參考圖像進行訓練和標準化
• 保存典型匯合階段的照片記錄
• 盡可能使用 ImageJ 或匯合度分析軟體等量化工具
• 採用自動成像系統進行客觀監測

防止過度匯合的策略

過度匯合是一個可預防的問題，但它可能會破壞整個實驗。使用這些主動策略：

1. 定期監測： 每天在顯微鏡下檢查您的培養物並記錄觀察結果。意想不到的成長突增可能會迅速發生。
2. 優化播種密度： 開始時細胞過多可能會導致快速過度生長。根據您的細胞類型、容器大小和應用客製化接種密度。
3. 使用更大的培養容器： 如果頻繁傳代變得繁重，則擴大到更大的培養瓶或培養板可能會減少處理頻率。
4. 調整介質更換頻率： 快速生長的細胞可能會很快耗盡營養。更頻繁地更換培養基有助於維持生存能力並延遲匯合。
5. 最佳化培養條件： 確保適當的二氧化碳含量、濕度和溫度。受到壓力的細胞可能會表現得不可預測，進而影響生長動力。
6. 建立 SOP 和閾值： 在您的協議中定義明確的匯合閾值 - 例如「當 80％ 匯合時傳代細胞」 - 以提高整個實驗室的一致性。

4. 存活率

細胞活力 是整體細胞健康的關鍵指標，對於確保可靠和可重複的實驗結果至關重要。無論您進行轉染、藥物測定、分化研究或準備細胞進行冷凍保存，保持高活力百分比都有助於確保一致且生理相關的結果。

生存能力低下會導致：

• 由於死亡或瀕死細胞的干擾，導致檢測結果失真
• 觸發改變基因和蛋白質表現的壓力反應
• 轉染或感染效率較低
• 造成批次間不一致，從而破壞可重複性

目標閾值

• 健康的細胞培養具有以下特點 80，95％，並且通常建議用於大多數標準實驗。
• FDA 指南： 對於 離體 基因修飾細胞（例如 CAR-T、MSCs），FDA 建議最低存活率 70%。如果較低，支持數據必須表明它不會影響 安全, 功效， 或者 交貨因為死細胞或碎片可能會影響治療效果。

如何評估可行性

• 台盼藍排斥法： 使用血球計數器或自動計數器的簡單手動計數方法。
• 使用活性染料進行流式細胞儀 （例如，PI、7-AAD）：允許多參數分析。
• 螢光或比色測定 （例如 MTT、Resazurin）：適用於高通量篩選。

FBS在細胞活力中的作用

FBS 是許多培養基配方中最關鍵的成分之一。它提供 必需生長因子、荷爾蒙、黏附分子以及支持 細胞附著、增殖和存活.

運用 值得信賴的高品質FBS 對於維持生存至關重要，因為：

• 品質差或不穩定的FBS可能導致 不可預測的細胞行為 生存能力低。
• 受污染或熱滅活不當的FBS可能導致 細胞毒作用.
• 批次間差異 FBS 中的殘留物會導致實驗結果不一致，除非 FBS 經過嚴格測試和驗證.

導致存活率低的常見原因

• 解凍或凍融循環不理想
• 過度匯合培養導致營養耗盡
• 嚴酷的酶促分離
• 污染（例如， 支原體、內毒素)
• 培養基品質差或補充資料不適當，例如 胎牛血清 (FBS) 不穩定或不一致

提升細胞活力的技巧

• 使用 預熱的完整培養基 - 高品質胎牛血清
• 避免過度處理或將細胞長時間暴露在室溫下
• 優化酶促分離條件
• 保持適當的 播種密度 解凍後促進恢復
• 執行常規品質控制（例如支原體檢測、培養基 pH 值、滲透壓檢查）

高生存力不僅意味著生存，還意味著 確保你的細胞健康、活躍並表現正常。值得信賴的試劑如 認證FBS 形成可靠文化體系的骨幹。

5. 支原體檢測頻率

支原體污染 是細胞培養中最隱密且最難診斷的問題之一。與細菌或真菌污染不同，支原體不會引起培養基混濁，而且常常不被注意，但會默默地破壞實驗的完整性。

這些微小的、無細胞壁的細菌可以：

• 改變細胞代謝、增殖和基因表達
• 幹擾轉染效率和細胞激素反應
• 影響可重複性並導致錯誤的實驗結論
• 數週或數月內不易被發現，尤其是在共用孵化器或實驗室中

建議的測試頻率

需要頻繁監測的高風險場景

• 共享或核心實驗室 環境中
• 長期文化 實驗
• 與實驗室合作 原代細胞或幹細胞S
• 實驗室使用 混合或共培養
• 製備細胞的設施 臨床或臨床前用途

測試方法

• PCR試劑盒: 快速、靈敏、應用廣泛
• DNA染色（例如， 赫斯特 33258)：適用於基於顯微鏡的檢測
• 酶促測定： 常規篩檢快速簡便
• 基於培養的檢測： 黃金標準，但耗時且不適合快速決策

最佳實踐

• 檢疫 新的細胞系，直到清除
• 維護詳細記錄 所有測試結果
• 實施 標準作業程序 用於污染響應
• 避免長期使用抗生素 掩蓋污染

主動、定期的支原體檢測和頻繁 支原體淨化實踐 只要投入少量的時間，就能節省數月的勞動時間。

6. 培養基pH範圍

培養基pH值 在影響力方面發揮著至關重要的作用 細胞活力、新陳代謝、酵素活性和 整體實驗可重複性。任何偏離最佳 pH 範圍的情況都可能導致細胞行為改變、數據不可靠，甚至培養完全失敗。維持穩定的 pH 值對於敏感細胞類型（例如原代細胞和幹細胞）尤其重要。

哺乳動物細胞的最佳pH值範圍通常在 7.2 – 7.4。 pH 值低於 7.2 被視為酸性，而 pH 值高於 7.4 被視為鹼性。

細胞培養基pH值的變化顯示什麼？

酸性條件 – 通常表示 過度生長的文化 或可能 微生物污染。當細胞代謝營養物質時，它們會釋放乳酸等酸性副產物，從而降低 pH 值。這在密集的文化中或當培養基變化不頻繁時尤其常見。

鹼性條件 – 可能源自於 二氧化碳不足₂ 各級 在孵化器中或 延長曝露 培養皿中的空氣。當細胞代謝不活躍時，例如細胞死亡後或解凍後的早期階段，也會發生這種情況。

pH調節機制

1. 酚紅指示劑

酚紅是細胞培養基中常見的 pH 指示劑，它會從粉紅色（中性）變為橙色或黃色（酸性），從而 視覺提示 即時監控媒體狀況。培養基變黃表示酸度增加，通常表示需要更換培養基，無論預定的餵食時間表如何。

酚紅會影響細胞嗎？

在大多數情況下，酚紅是無害的，並且有助於維持健康的培養。然而，某些 敏感細胞系或實驗裝置 可能需要 無酚紅培養基。這是因為酚紅表現出弱的雌激素樣活性，可以影響激素反應細胞或乾擾對雌激素化合物敏感的檢測。它也可能在流式細胞儀或螢光分析等技術中引起背景訊號。對於這些情況，最好使用不含酚紅的配方。

2. 碳酸氫鈉-CO₂緩衝系統

碳酸氫鈉 (NaHCO₃) 是一種天然、無毒的緩衝液，常用於細胞培養基。需要 5% 二氧化碳培養箱 起到緩衝作用，因為二氧化碳溶解在培養基中，形成碳酸，碳酸與碳酸氫根離子相互作用， 穩定pH值.

培養基中的 NaHCO₃ 量決定了維持 pH 值所需的 CO₂ 量。一般認為正常組織的生理 pH 值在 7.2 至 7.4 範圍內，但某些疾病狀態（例如癌症）可能需要在較低的 pH 值下進行培養。添加 Earle 平衡鹽溶液 (EBSS) 的 Eagle 最低必需培養基 (EMEM) 和大多數其他細胞培養基通常含有 26mM 碳酸氫鈉，而 DMEM 的濃度更高，為 44mM。

3. HEPES緩衝液－用於在CO₂培養箱外保持pH值穩定

HEPES（4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸）是一種 兩性離子有機緩衝液 廣泛用於細胞培養以維持穩定的pH值，特別是在二氧化碳水平可能波動的環境中。 HEPES 在 pH值範圍為6.8至8.2，使其適用於多種哺乳動物細胞系。

為什麼要使用 HEPES？

• 強大的緩衝能力： HEPES 比碳酸氫鈉提供更穩定的 pH 控制，特別是在二氧化碳濃度不穩定的環境中。
• CO₂-獨立緩衝： 與碳酸氫鹽不同，HEPES 不需要 CO₂ 即可發揮作用，這使其成為在標準培養箱外進行的實驗的理想選擇（例如，活體成像、流式細胞儀和分子生物學測定）。
• 最小pH值漂移： HEPES 有助於防止細胞暴露在周圍空氣中時 pH 值的快速變化，從而提高培養箱外處理時的一致性。

Biowest 基礎培養基－滿足各種細胞培養需求的彈性配方

生物西 提供廣泛的基礎培養基配方，以滿足研究不同細胞類型和實驗條件的研究人員的不同需求。無論是培養強大的永生細胞系、敏感的原代細胞或幹細胞，Biowest 都能提供 即用型培養基 含或不含 HEPES 和碳酸氫鈉，以支持最佳 pH 控制和緩衝。

標準選項包括：

• 含碳酸氫鈉： 非常適合在 5% CO₂ 培養箱中使用，支援經典的碳酸氫鹽緩衝系統。
• 使用 HEPES 緩衝液： 適用於需要在 CO₂ 培養箱外保持穩定 pH 值的實驗，例如即時成像、流式細胞儀或現場採樣。
• 不含HEPES/碳酸氫鹽： 可依特定實驗需求靈活客製化緩衝系統。

7. 內毒素水平

內毒素，也稱為 脂多醣（LPS）， 是革蘭氏陰性菌外膜的組成部分。這些分子可以在細菌生長過程中少量釋放，在細菌裂解時大量釋放。即使是微量的內毒素也會損害培養細胞的健康，特別是在幹細胞擴增、免疫療法開發、生物生產或發炎疾病建模等敏感應用中。它們的影響通常很微妙，但可能導致不穩定、不可重複或誤導的實驗結果。

內毒素如何影響細胞培養結果

即使濃度較低，內毒素也能：

• 刺激細胞激素和趨化因子的分泌 （尤其是免疫相關細胞）
• 活化發炎訊號和氧化壓力通路
• 破壞 正常細胞增生、分化與形態
• 損害蛋白質表達 在重組系統中
• 降低細胞活力 or 誘導細胞凋亡—特別是在原代細胞或幹細胞培養中

特別容易受到內毒素影響的細胞類型包括：

• 免疫細胞： 巨噬細胞、樹突狀細胞、PBMC
• 幹細胞： MSCs、ESCs、iPSCs
• 用於轉染、病毒載體生產或治療性蛋白質製造的細胞

內毒素污染的常見來源

內毒素可以透過多種途徑進入您的培養系統：

• 水 用於緩衝液或試劑的製備
• 商業來源 培養基、血清和補充劑
• 受污染的實驗室器具 （玻璃或塑膠）
• 消毒不當 或重複使用培養容器
• 暴露於空氣或 無菌技術差

Biowest品質保證

比奧韋斯t提供 FBS 和基礎培養基 經過 LAL 測試並提供 批次特定分析證書 內毒素水平，確保 一致性和可靠性 跨實驗。其嚴格的品質控制流程支援可重複的高效能結果—即使在最敏感的應用中也是如此。

Biowest 的 超低內毒素胎牛血清 是專門為滿足敏感細胞培養系統的嚴格要求而設計的。每批都經過精心配製和徹底測試，符合嚴格的內毒素閾值，使其成為培養原代細胞、幹細胞和用於臨床或生物製藥應用的細胞的理想選擇。有了 Biowest，您可以放心，您的細胞在支持以下兩種環境的環境中生長： 生存力和完整性.

結論

細胞培養既是一門數位科學，也是一門技術科學。掌握關鍵的定量參數—例如 傳代次數、接種密度和匯合率—可能意味著可重複的結果和實驗失敗之間的差異。同樣重要的是不太明顯但關鍵的指標，例如 活力、支原體檢測頻率、培養基 pH 值和內毒素水平。這七個數字共同構成了強大、可靠的細胞培養系統的基礎。透過保持警惕並了解這些價值觀，研究人員可以提高一致性，保護細胞健康，並確保有意義的結果——無論是使用標準細胞系還是推進敏感的臨床應用。

參數支持

Bio，C.（2024 年 19 月 XNUMX 日）。 了解細胞培養基中的 pH 值和滲透壓。吸引生物。 https://captivatebio.com/understanding-ph-osmolality-cell-culture-media/

細胞培養：技術、類型和生長監測 |丹納赫生命科學。 （nd）。丹納赫生命科學公司。 https://lifesciences.danaher.com/us/en/library/cell-culture.html#:~:text=The%20optimal%20CO2%20level%20for,can%20be%20toxic%20to%20cells.

細胞活力測定 |艾博抗。 （nd）。 https://www.abcam.com/en-us/technical-resources/guides/cell-health-guide/cell-viability-assays#:~:text=Briefly%2C%20cell%20viability%20is%20the,get%20washed%20away%20during%20trypsinizing.

細胞培養實驗室中的二氧化碳濃度和pH值控制。 （nd）。文化收藏。 https://www.culturecollections.org.uk/culture-collection-news/co2-concentration-and-ph-control-in-the-cell-culture-laboratory/

維持細胞 | ATCC。 （nd）。 https://www.atcc.org/the-science/culturing-cells/maintaining-cells

Office，S.（2025 年 25 月 XNUMX 日）。 IND 應用的細胞和基因治療的 CMC 要求 |生物阿吉利特。 BioAgilytix。 https://www.bioagilytix.com/blog/cmc-requirements-for-cell-and-gene-therapy-for-ind-applications/

活細胞百分比。 （nd）。科學直接。 https://www.sciencedirect.com/topics/immunology-and-microbiology/percentage-of-viable-cells