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NCG 模型
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應變描述
NCG (NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt) 是利用基因編輯技術敲除 NOD/ShiltJGpt 小鼠的 Prkdc（蛋白激酶、DNA 活化、催化多肽）和 Il2rg（共同伽瑪鏈受體）基因而獲得的嚴重免疫缺陷品系。
NOD/ShiltJGpt的遺傳背景使得該菌株攜帶先天性免疫缺陷，例如補體系統和巨噬細胞的缺陷；同時，來自此背景的Sirpa對人類CD47具有高親和力，使得NOD/ShiltJGpt比其他菌株更適合在腫瘤和人體細胞等人體移植物中定植。
Prkdc 基因的功能使得 V(D)J 重組以及 T 細胞和 B 細胞的成熟變得不可能。
IL2RG是多種白介素細胞激素受體的共享亞基； IL2RG失活會導致6個細胞激素訊號通道缺失，導致NK細胞缺陷。
有鑑於此，NCG作為最徹底的免疫缺陷小鼠模型之一，非常適合細胞系來源的異種移植（CDX）、患者來源的異種移植（PDX）以及人類外周血單核細胞（PBMC）的免疫重建以及人類造血幹細胞（CD34+ HSC）移植。
NCG生命週期長（>89週），適合長期移植及藥效學評估。
應用領域
- 人源化免疫系統小鼠模型，如人源化BLT小鼠、人源化PBMC小鼠和人源化CD34+ 老鼠;
- 人類細胞系來源的異種移植物、病人來源的異種移植物（CDX、PDX）；
- 療效評估（小分子/大分子藥物、合併治療）；
- 人類癌症模型；
- 幹細胞研究
驗證數據
1. NCG週邊血免疫細胞亞群統計
圖1 NOD、NOD-Scid和NCG小鼠週邊血免疫細胞分數百分比統計圖（n=5）
取7週齡NOD、NOD-Scid和NCG小鼠的周邊血液進行流式測定，以確定其免疫細胞分數的比例。結果顯示，與NOD相比，NOD-Scid幾乎沒有T細胞和B細胞，NK細胞比例代償性增加，DC細胞、嗜中性球、單核球和嗜酸性球比例增加，巨噬細胞比例減少。與NOD相比，NCG幾乎沒有T、B、NK細胞和巨噬細胞，免疫缺陷比NOD-Scid更完全。
2. NCG脾臟免疫細胞亞群統計
圖2 NOD、NOD-Scid和NCG小鼠脾臟免疫細胞分數百分比統計圖(n=5)
取7週齡NOD、NOD-Scid和NCG小鼠的脾臟進行流式分析以確定其免疫細胞分數比。結果顯示，與NOD相比，NOD-Scid幾乎沒有T細胞和B細胞，NK細胞比例代償性增加，DC細胞、嗜中性球、單核球、嗜酸性球和巨噬細胞比例升高。與NOD相比，NCG幾乎沒有T、B和NK細胞，免疫缺陷程度較高。
3. NCG骨髓免疫細胞亞群統計
圖3 NOD、NOD-Scid和NCG小鼠骨髓免疫細胞分數百分比統計圖（n=5）
取7週齡NOD、NOD-Scid及NCG小鼠骨髓進行流式檢測，測定各亞群（造血幹細胞、Pre-pro-B、Pro-B、Pre-B、未成熟B）的比例B 細胞產生過程中的過渡B、早熟B、晚熟B)。結果顯示，與NOD相比，NOD-Scid和NCG小鼠骨髓中Pre-pro B細胞和Pro B細胞含量增加，而Pre B細胞、早/晚成熟B細胞含量減少。此外，與 NOD 和 NOD-Scid 小鼠相比，NCG 小鼠骨髓中的移行 B 細胞顯著增加。
4. 脾臟、胸腺和淋巴結的 NCG H&E 染色
圖 4. NOD、NOD-Scid 和 NCG 小鼠脾臟、胸腺和淋巴結的 H&E 染色
將7週齡NOD、NOD-Scid和NCG小鼠的脾臟、胸腺和淋巴結固定在4%PFA中，石蠟包埋、切片並H&E染色，以確定其器官結構是否有異常。結果顯示，NOD小鼠脾臟腹膜完整，未見增厚。脾竇未見擴張，脾小泡大小無異常變化，紅白髓質比例近似正常；胸腺完整，皮質、髓質正常，髓質內可見胸腺小泡，未見出血、萎縮等病理性變化。淋巴結皮質與髓質比例正常，淋巴球未減少或壞死。相較之下，NOD-Scid和NCG小鼠的脾臟淋巴結體積縮小，淋巴球數量減少；胸腺皮質、髓質界線不清，胸腺萎縮，皮質、髓質淋巴球明顯減少。淋巴結皮質、髓質界線不清，皮質萎縮，皮質、髓質淋巴球明顯減少。 H&E讀數結果與身體視力和血流結果一致。
另外，取7週齡NOD、NOD-Scid和NCG小鼠心臟、肝臟、肺、腎、結腸和睪丸(雄性)進行H&E染色。結果表明，XNUMX株器官組織結構均正常。
5.NCG器官指數和淋巴結數量
圖 5. NOD、NOD-Scid 和 NCG 小鼠器官指數和淋巴結數量比較（n=10）
取7週齡NOD、NOD-Scid和NCG小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦和睪丸(雄性)進行器官稱重併計算器官指數。結果顯示，與NOD小鼠相比，NOD-Scid和NCG小鼠的脾臟指數顯著降低，且NCG小鼠的降低更為顯著。其餘器官指數無顯著差異。
另外，透過對小鼠頸部淋巴結、腋窩淋巴結、腹股溝淋巴結、腸系膜淋巴結和配對淋巴結進行計數，結果顯示，與NOD相比，NOD-Scid和NCG小鼠的淋巴結數量明顯減少小鼠，而所有NCG小鼠均無腹股溝淋巴結、腸繫膜淋巴結及配對淋巴結。
6. NCG成長曲線
圖6 NCG小鼠生長曲線
對 16 週大的 NCG 小鼠進行體重分析。結果顯示，NCG雄性小鼠的體重普遍高於雌性小鼠。
7. 血液常規分析
| 點頭 | NOD-Scid | NCG | ||||
| 女性(n=5)
(平均值±SEM) |
男性(n=5)
(平均值±SEM) |
女性(n=5)
(平均值±SEM) |
男性(n=5)
(平均值±SEM) |
女性(n=5)
(平均值±SEM) |
男性(n=5)
(平均值±SEM) |
|
| 白血球(K/uL) | 2.37± 0.77 | 2.45± 1.16 | 1.37± 0.46 | 1.19± 0.28 | 0.88± 0.21 | 1.15± 0.26 |
| 萊姆(K/uL) | 1.35± 0.38 | 1.24± 0.70 | 0.26± 0.08 | 0.30± 0.06 | 0.12± 0.04 | 0.29± 0.15 |
| 週一(K/uL) | 0.227± 0.15 | 0.28± 0.15 | 0.20± 0.07 | 0.10± 0.06 | 0.04± 0.02 | 0.05± 0.03 |
| 新 (K/uL) | 0.67± 0.29 | 0.81± 0.35 | 0.79± 0.32 | 0.72± 0.20 | 0.66± 0.19 | 0.76± 0.13 |
| Eos (K/uL) | 0.12± 0.06 | 0.12± 0.02 | 0.10± 0.05 | 0.07± 0.02 | 0.07± 0.02 | 0.05± 0.01 |
| 巴斯 (K/uL) | 0.01± 0.01 | 0.01± 0.01 | 0.01± 0.01 | 0.003± 0.006 | 0.00± 0.00 | 0.00± 0.00 |
| 紅血球(M/uL) | 7.68± 0.22 | 8.00± 0.35 | 7.46± 0.40 | 8.39± 0.84 | 7.98± 0.68 | 7.87± 0.54 |
| 血紅素(g/L) | 144.60± 4.83 | 149.00± 4.64 | 134.60± 6.27 | 147.80± 11.39 | 143.00± 11.90 | 140.20± 9.68 |
| 血球比容(%) | 39.88± 1.15 | 42.04± 1.85 | 38.82± 2.34 | 43.64± 4.13 | 41.24± 3.63 | 40.82± 3.29 |
| MCV (fL) | 51.96± 0.53 | 52.62± 0.62 | 52.10± 0.66 | 52.12± 0.62 | 51.74± 0.35 | 51.90± 0.85 |
| 婦幼保健院（頁） | 18.76± 0.31 | 18.60± 0.40 | 18.00± 0.16 | 17.62± 0.43 | 17.88± 0.15 | 17.76± 0.30 |
| MCHC(克/升) | 362.00± 4.95 | 354.20± 5.98 | 346.40± 6.07 | 338.80± 8.64 | 346.60± 3.78 | 343.20± 5.54 |
| RDW_CV(%) | 13.12± 0.16 | 13.46± 0.49 | 13.70± 0.70 | 13.60± 0.20 | 13.44± 0.34 | 13.92± 0.18 |
| RDW_SD(fL) | 42.84± 1.18 | 42.68± 0.75 | 43.20± 0.96 | 43.20± 1.13 | 43.02± 1.00 | 42.52± 1.06 |
| PLT(K/uL) | 1289.6± 89.45 | 1482.60± 175.24 | 1375.40± 167.61 | 1533.60± 236.50 | 1226.20± 171.79 | 1665.60± 45.92 |
| MPV (fL) | 4.84± 0.17 | 5.06± 0.23 | 4.86± 0.09 | 4.74± 0.11 | 4.74± 0.20 | 4.78± 0.11 |
| PDW(fL) | 10.62± 0.57 | 11.42± 0.86 | 10.64± 0.36 | 10.62± 0.43 | 10.54± 0.75 | 10.64± 0.22 |
| 百分比(%) | 0.62± 0.05 | 0.74± 0.07 | 0.66± 0.09 | 0.72± 0.12 | 0.58± 0.06 | 0.79± 0.03 |
| P_LCR(%) | 19.82± 1.73 | 22.62± 3.13 | 20.85± 1.18 | 19.86± 1.72 | 18.77± 2.63 | 19.33± 1.48 |
| P_LCC(K/uL) | 255.0± 23.24 | 331.80± 32.77 | 286.60± 42.51 | 304.40± 60.66 | 226.60± 17.04 | 321.40± 27.20 |
| NRBC(K/uL) | 5.28± 11.50 | 10.77± 14.56 | 0.30± 0.54 | 0.36± 0.72 | 0.03± 0.01 | 0.04± 0.01 |
| ALY(K/uL) | 0.03± 0.008 | 0.03± 0.02 | 0.001± 0.002 | 0.003± 0.005 | 0.00± 0.00 | 0.01± 0.01 |
| LIC(K/uL) | 0.01± 0.006 | 0.01± 0.002 | 0.01± 0.006 | 0.01± 0.006 | 0.01± 0.003 | 0.01± 0.004 |
表 1. 7 週齡 NOD、NOD-Scid 和 NCG 小鼠的全血球計數分析
8. 血液生化分析
| 點頭 | NOD-Scid | NCG | ||||
| 女性(n=5)
(平均值±SEM) |
男性(n=5)
(平均值±SEM) |
女性(n=5)
(平均值±SEM) |
男性(n=5)
(平均值±SEM) |
女性(n=5)
(平均值±SEM) |
男性(n=5)
(平均值±SEM) |
|
| ALT(國際單位/公升) | 21.72± 5.47 | 34.48± 4.60 | 24.04± 7.87 | 62.56± 40.44 | 51.44± 67.41 | 41.40± 12.92 |
| 穀草轉氨酶（國際單位/公升） | 131.64± 41.36 | 160.28± 38.45 | 130.64± 13.96 | 191.12± 67.60 | 168.24± 100.82 | 142.00± 36.95 |
| CK（毫克/升） | 296.40± 222.91 | 572.80± 346.63 | 198.40± 25.67 | 337.20± 165.49 | 194.00± 20.35 | 196.40± 40.65 |
| ALB(克/公升) | 42.16± 2.00 | 40.28± 2.36 | 42.68± 3.20 | 39.64± 2.77 | 42.36± 2.03 | 40.44± 2.71 |
| 總膽紅素(微摩爾/公升) | 1.69± 0.67 | 2.38± 0.43 | 1.84± 0.21 | 2.33± 0.51 | 1.38± 0.40 | 1.95± 0.71 |
| BUN(毫摩爾/公升) | 7.28± 0.92 | 8.97± 1.00 | 8.11± 1.02 | 10.55± 1.27 | 8.20± 0.70 | 8.46± 1.02 |
| CREA(微摩爾/公升) | 7.40± 3.72 | 6.36± 2.45 | 5.96± 1.04 | 8.12± 1.15 | 6.40± 1.92 | 6.76± 2.30 |
| CHO(毫摩爾/公升) | 2.68± 0.17 | 3.88± 0.44 | 2.47± 0.31 | 3.06± 0.47 | 2.32± 0.30 | 3.58± 0.31 |
| TG(毫摩爾/公升) | 0.62± 0.23 | 1.35± 0.62 | 0.70± 0.32 | 1.65± 0.91 | 0.45± 0.17 | 1.52± 0.46 |
| LDH(國際單位/公升) | 2738.80± 527.71 | 2986.40± 579.96 | 3297.20± 625.20 | 3470.00± 554.64 | 3258.00± 193.99 | 3557.2± 559.94 |
| LDL(毫摩爾/公升) | 0.29± 0.05 | 0.26± 0.01 | 0.25± 0.09 | 0.08± 0.04 | 0.30± 0.08 | 0.31± 0.07 |
| 谷氨酸(毫摩爾/公升) | 1.52± 0.74 | 1.44± 0.87 | 1.02± 1.06 | 3.36± 2.04 | 0.64± 0.67 | 2.26± 1.78 |
| 高密度脂蛋白膽固醇(毫摩爾/公升) | 2.06± 0.14 | 3.09± 0.34 | 1.86± 0.24 | 2.42± 0.37 | 1.71± 0.23 | 2.78± 0.22 |
| TP(克/公升) | 59.88± 4.68 | 62.96± 4.02 | 58.56± 4.37 | 61.20± 4.84 | 57.96± 1.97 | 61.52± 4.05 |
| AKP(國際單位/公升) | 213.20± 10.35 | 182.40± 10.71 | 184.80± 21.48 | 160.00± 10.49 | 205.60± 7.54 | 150.40± 14.99 |
表2. 7週齡NOD、NOD-Scid和NCG小鼠的血液生化分析
9. NCG致瘤性試驗
圖7. NCG小鼠致瘤性試驗
將人類乳癌細胞株BT-474、人結腸癌細胞株COLO205、人類胰臟癌細胞株PANC1和人類卵巢癌細胞株SK-OV-3皮下接種到6-8週齡的Nu/NOD-Scid/NCG小鼠體內分別處於對數生長階段，腫瘤大小隨時間呈現梯度曲線生長。 (腫瘤體積值表示為平均值±SEM)。
10. NCG功效測試
圖8 厄洛替尼在NCG小鼠皮下移植肺癌PDX模型的藥效評價
建構NCG小鼠皮下移植肺癌PDX模型來評估厄洛替尼的抗腫瘤作用。結果顯示，與模型對照組相比，厄洛替尼治療組能夠顯著抑制腫瘤生長。此外，與單獨使用厄洛替尼組相比，與阿瓦斯汀合併用藥可顯著抑制腫瘤生長。 (腫瘤體積值表示為平均值±SEM)。
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