细胞外囊泡 (EV) 和外泌体因其在诊断、治疗和生物标志物发现中的作用而日益受到关注。这些微小囊泡携带来自其亲本细胞的蛋白质、RNA 和其他物质，充当 自然信使 对受体细胞具有功能性影响，并在细胞间通讯中发挥核心作用。

外泌体是纳米大小的细胞外囊泡，直径通常为 30-150 纳米，由大多数细胞类型分泌，并且存在于几乎所有生物体液中 - 包括血浆、血清、唾液、脑脊液、尿液和细胞培养基。 它们包裹着来自其来源细胞的各种生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质和代谢物，作为细胞间通讯的天然载体。外泌体最初被认为主要负责细胞废物处理，但后来的研究揭示了它们在调节生理和病理过程中的关键作用。

例如， 间充质干细胞衍生的外泌体（MSC-Exosomes） 外泌体因其再生和治疗潜力而被广泛研究。除了再生医学之外，外泌体目前还被探索作为 诊断和预后生物标志物 用于治疗癌症、心血管疾病、结核病和神经退行性疾病。其固有的生物相容性、低免疫原性和高效的载药能力也使其前景广阔。 药物输送系统，目前正在进行研究其在癌症和阿尔茨海默病治疗中的应用。

然而，要发挥这种潜力，需要周密的规划、可重复的工作流程和优化的分析工具。

在这篇博客中，我们将介绍 电动汽车实验室的一天跟踪囊泡从培养到浓缩、分离、储存、表征、货物分析和功能化的过程——突出真实的实验室经验、最佳实践和实用技巧。

一天从培养箱开始。你的细胞正在茁壮成长，但有一个隐藏的挑战：培养基本身可能会 引入电动汽车污染标准胎牛血清 (FBS) 含有牛源性 EV 和非 EV 颗粒（如脂蛋白），这些颗粒可能会影响结果或降低表观产量。

实验室里发生了什么：

• 您将间充质干细胞 (MSCs) 或免疫细胞接种于 EV 耗尽的培养基。 细胞继续其正常的分泌活动，在几天内将 EV 释放到条件培养基中。
• 在此期间，维持最佳培养条件（温度、二氧化碳水平和细胞密度）至关重要，因为受压细胞会释放凋亡小体，即较大的囊泡，可能会使下游分析复杂化。

解决方案：

• EV-耗尽的FBS – 减少血清培养物的背景 EV 污染。
• 外泌体耗尽的HPL – 优化人类血小板裂解物以避免外源性囊泡。
• Xtract Media（即将推出） – 一种专为高产量 EV 生产而设计的化学定义培养基。

Tips:	陷阱
在开始实验之前，预先调节培养基并确认污染囊泡已耗尽。	过度汇合的细胞培养可能会因接触抑制生长或接触诱导衰老而改变 MSCs 的治疗潜力。

培养期结束后，您的培养基中富含EV，但它们分散在大量细胞中，导致分离效率低下。在大多数EV工作流程中，样品首先会被浓缩 （通常为 5-40 倍） 纯化前，由于条件培养基通常过于稀释，无法直接处理。因此，浓缩是培养和分离之间的关键桥梁。

实验室里发生了什么：

• 你小心地将条件培养基转移到 切向流过滤（TFF） 系统。培养基在半透膜上循环，允许小分子和水通过，同时保留和浓缩EV。
• TFF 非常适合处理大体积（例如 >250 mL），它采用具有明确分子量截止值 (MWCO) 的膜——通常为 100 kDa、300 kDa 或 750 kDa——具体取决于所需的纯度和囊泡的特性。
• 整个过程中轻柔的操作至关重要；过大的压力、高剪切力或剧烈的离心可能会损坏囊泡膜或改变其表面特性。

解决方案：

• qEV TFF（切向流过滤） – 可扩展且温和的浓缩方法，可保持 EV 的完整性。

Tips:	陷阱
监测流速和压力以避免囊泡变形。	过度浓缩会增加粘度，导致随后的分离过程中发生聚集或损失。

纯度至关重要。经TFF浓缩后，样品密度会更高，但仍含有不需要的蛋白质、脂蛋白和其他非囊泡颗粒。为了获得生物学相关性和可重复性的数据，必须去除这些污染物——这才是真正的囊泡分离的起点。

实验室里发生了什么：

• 运用 尺寸排阻色谱 (SEC)，浓缩样品被装载到 qEV 柱当它在轻微重力作用下流过填充的树脂时，较大的 EV 首先洗脱，而较小的蛋白质、脂蛋白和其他可溶性污染物则被延迟。
• 由于 qEV 依赖于重力而不是压力，因此该过程非常温和——保留了囊泡的形态、膜完整性和生物功能。
• 对于寻求更高一致性和可重复性的研究人员来说， 亚足联系统 自动从 qEV 柱中收集馏分。这确保了对馏分时间和体积的精确控制，最大限度地减少了用户操作差异，并简化了工作流程。
• 对于大规模生产， qEV Zenco— 与 qEV 柱集成的 FPLC 系统 — 可实现自动化、可扩展的 EV 分离，同时保持相同的温和 SEC 原理。
• 同时， qEV Dxter 提供高通量处理能力，允许在核心设施或大型研究项目的并行仪器中同时分离多个样本。

解决方案：

• qEV SEC 隔离柱 – 手动或自动尺寸排阻色谱法，用于高纯度 EV 分离。
• 亚足联系统 – 自动收集馏分，实现一致、可重复的 EV 纯化并减少人工操作。
• qEV Zenco – 基于 FPLC 的大规模 EV 隔离自动化。
• qEV Dxter – 用于跨多个列进行多样本处理的高通量系统。

Tips:	陷阱
匹配您的 隔离方法 满足您的样品量和吞吐量需求。	跳过柱平衡或清洗不充分可能会引入污染物，从而影响下游特性。

分离后，妥善储存对于维持囊泡功能至关重要。囊泡非常脆弱——不适当的条件会损害膜的完整性、导致聚集或降解其RNA和蛋白质。然而，储存仍然是囊泡工作流程中标准化程度最低的步骤之一。

通常情况下，分离的EVs被重新悬浮在 磷酸盐缓冲溶液（PBS） 并存储在 −80 °C 或更低因为4°C冷藏会导致颗粒数量减少、粒径分布改变以及表面标志物表达下降。即使在-80°C下，反复的冻融循环也会导致囊泡破裂并引起聚集。

为了应对这些挑战，研究人员转向 冻干（冷冻干燥）。正如最近的研究强调的那样，冻干的 EV（尤其是那些在保护缓冲液中稳定的 EV）可以保留其 尺寸、形态和生物功能 即使在很长一段时间内 室内温度。这种方法为电动汽车的长期保存和运输提供了一种更实用、更经济的替代方案，无需持续依赖冷链。

实验室里发生了什么：

• 将新分离的 EV 分装到冷冻管中，以尽量减少冻融循环。
• 有些批次采用冻干 EVSafe 冻干缓冲液，可长期在常温下储存。重构后，EV 的粒径和 zeta 电位变化极小，可进行下游分析或功能检测。

解决方案：

• EVSafe 存储缓冲区 – 冷冻过程中保持EV稳定性，回收率>95%。在-80°C储存期间，可防止聚集并保持粒度分布。
• EVSafe 冻干缓冲液 – 专为冻干囊泡而设计，同时保持囊泡结构和功能（回收率约 85%）。易于重构，可用于下游应用，并可在室温下稳定储存。

Tips:	陷阱
始终将 EV 分装成一次性使用的体积，以防止因反复解冻而导致降解。	不使用冷冻保护剂冷冻或解冻 EV 会导致囊泡破裂并降解 RNA/蛋白质货物，从而严重影响检测的可重复性。

仅靠分离并不能保证成功。表征可以验证您真正分离的内容——确保您的样品包含完整的EVs，而不是蛋白质聚集体或脂蛋白。正确的表征对于 可重复性、研究之间的可比性，并确保观察到的生物效应确实是由 EV 介导的。

为什么它的事项：

物理和表面特性可以洞察 尺寸、浓度、电位和膜成分——影响EV稳定性、细胞摄取和功能行为的关键参数。了解 尺寸分布 有助于区分小型 EV（外泌体，~30-150 纳米）与微囊泡或非囊泡颗粒。 Zeta 电位 反映表面电荷和胶体稳定性，而 颗粒浓度 为功能分析中的准确剂量提供信息。

实验室里发生了什么：

• 一小部分孤立的电动汽车被装载到 外星人，它的用途 可调电阻脉冲传感 (TRPS) 单独测量每个粒子。这提供了 真实的颗粒大小、浓度和电位 数据，避免了在总体或混合人群中常见的偏见 动态光散射 (DLS) or 纳米粒子跟踪分析（NTA）.
• 透射电子显微镜（TEM） 用于可视化 EV 形态，确认经典的杯形结构并验证不存在碎片或蛋白质聚集体。
• 对于表面轮廓， 流式细胞仪 使用执行 ExoBrite™ True EV 膜染料。 不像 传统亲脂性染料，如 Dil 或 PKH—可诱导EV聚集—ExoBrite™选择性染色完整的EV膜，且聚集程度最低。当与 ExoBrite™ CD 标记特异性抗体 （例如 CD63、CD81、CD9），它可以准确检测典型的 EV 标记并识别亚群。
• ExoBrite™ 西方抗体 提供用于检测EV蛋白标记物的优化抗体，包括CD9、CD63、CD81以及Calnexin（阴性对照），产生清晰、可重复的信号。这补充了EV的物理表征，为EV的身份提供了分子层面的确认。

解决方案：

• 冻干EV标准品 – 来自不同细胞来源的参考材料，用于校准和比较。
• Exoid（TRPS技术） – 精确测量颗粒大小、浓度和电位，具有单颗粒分辨率。
• ExoBrite™ True EV 膜染料 & CD 标记系列 – 通过流式细胞术对 EV 膜完整性和表面标记进行基于荧光的验证。
• ExoBrite™ 西方抗体 – 经过验证的抗体结合物可用于背景最少的蛋白质标记分析。

Tips:	陷阱
– 使用正交表征方法（TRPS、TEM、流式细胞术和蛋白质印迹）全面了解您的 EV 制备。 – 与传统染料相比，ExoBrite™ 减少了聚集和背景，确保了更准确的流式细胞术结果。	– 过度依赖单一技术（例如 DLS 或 NTA）可能会错误地表示尺寸或浓度，特别是在多分散样品中。 – 跳过表面标记的验证可能会忽略异质亚群或污染物，从而影响下游功能研究。

EV 的真正故事在于其内部。虽然分离和物理表征证实了囊泡的存在，但它们 分子货物——RNA、蛋白质和其他生物分子——通常驱动它们的生物活性了解 EV 携带什么对于揭示其在细胞间通讯中的作用、识别疾病生物标志物以及开发基于 EV 的治疗方法至关重要。

货物分析为何重要：

• 生物标志物发现： EV 反映了其亲本细胞的生理状态，因此对于 液体活检 和疾病监测。例如，肿瘤衍生的EV可能携带致癌RNA或蛋白质，可作为癌症的早期指标。
• 治疗发展： 许多治疗策略利用囊泡作为药物、RNA疗法或信号蛋白的天然运载载体。对“货物”进行表征可确保囊泡中含有预期的功能分子。
• 机制研究： 分析“货物”有助于理解健康和疾病状态下EV介导的细胞信号传导和细胞间通讯。功能分析可以揭示EV如何将RNA或蛋白质转移到受体细胞并诱导生物学效应。

实验室里发生了什么：

• 你用 专用 EVSafe 裂解缓冲液，可破坏囊泡膜，同时保留核酸和蛋白质的完整性。标准裂解试剂可能过于刺激，导致货物碎裂或降解。EV专用缓冲液的配方可在保持分子稳定性的同时有效释放内部内容物。
• RNA分析： 使用 ExoBrite™ EV 总 RNA 提取试剂盒，提取RNA用于 二代测序（NGS）, qPCR 或微阵列研究，可以对 EV 货物进行详细的转录组分析。
• 蛋白质分析： 蛋白质的定量和表征是通过 蛋白质印迹 or 质谱法，从而可以识别信号分子、酶或疾病相关蛋白质。
• 功能分析： 报告基因或细胞摄取试验可以评估EV货物在靶细胞中的输送和活性，从而深入了解生物学效应和治疗潜力。

解决方案：

• ExoBrite™ EV 总 RNA 提取试剂盒 – 针对 EV 进行了优化，即使对于低产量样本也能保持 RNA 完整性。
• EVSafe 裂解缓冲液 – 温和而有效，用于裂解囊泡，同时保持货物稳定性，以便进行下游分子和功能分析。

Tips:	陷阱
– 始终使用 EV 专用裂解缓冲液来保持 RNA 和蛋白质的质量，特别是对于 NGS 或质谱等敏感检测。 – 将分子分析与功能分析相结合，以验证货物是否具有生物活性。	– 恶劣的裂解条件会使 RNA 碎裂或使蛋白质变性，从而影响下游分析并掩盖功能见解。 – 跳过适当的裂解或纯化步骤可能会留下干扰准确货物定量的膜残留物。

最后，您的 EV 已准备好进行高级应用。除了其天然的生物学功能外，EV 还可以 跟踪、装载治疗货物或表面改性 增强目标定位、交付效率和稳定性。功能化使电动汽车能够成为 治疗和诊断工具使研究人员能够将它们引导至特定组织，保护RNA或药物等载体免于降解，并实现实时跟踪诊断。这种定制功能释放出的功能远远超出了天然细胞外囊泡单独实现的能力。

实验室里发生了什么：

• 使用 EVfect 转染试剂盒可以将治疗性RNA（例如siRNA、miRNA、mRNA或反义寡核苷酸）引入EVs。这样可以将功能性核酸靶向递送至受体细胞。
• 使用装饰 EV 表面 细胞外囊泡修饰试剂盒（SA-生物素）这种由 Sortase A 介导的酶促反应能够在 EV 膜上进行精确、稳定的蛋白质修饰，从而促进与靶向分子的结合。
• 随着 EVcraft表面改性套件，多种表面分子可以结合到EV上：
  • 抗体或纳米抗体 用于抗原特异性细胞靶向。
  • 配基 例如激动剂或细胞因子与同源受体结合以刺激细胞。
  • 抗吞噬蛋白 减少间隙并延长循环时间。
  • 报告基因或荧光探针 用于成像和追踪 EV 生物分布。
• 在所有这些操作过程中，您需要监控 EV 的完整性，以确保货物运送效率和囊泡稳定性得到维持。

解决方案：

• EVcraft表面改性套件 – 多功能表面结合，用于靶向、刺激、免疫逃避或成像。
• EVfect 转染试剂盒 – 将核酸（ASO、siRNA、miRNA、mRNA、质粒DNA）有效地输送到EV中。
• 细胞外囊泡修饰试剂盒（SA-生物素） – 使用 Sortase A 酶修饰进行精确的蛋白质标记。

Tips:	陷阱
– 优化货物负载和表面改造，以保持自然的电动汽车行为和吸收效率。 – 在下游应用之前，使用表征方法（Exoid、流式细胞术、TEM）验证 EV 功能化后的完整性。	– 货物超载或表面过度修饰可能会破坏电动汽车的稳定性、损害细胞吸收或引发不必要的免疫反应。

案例研究：将优化解决方案融入电动汽车研究

许多研究人员已成功将我们的EV解决方案融入其工作流程，从而实现更高的纯度、重现性和数据可信度。以下是这些工具如何支持基于EV的研究的实际应用的一些示例。

观看我们的 EV 和 Exosome 工作流程解决方案：

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参考文献：

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