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在临床规模上生产人类间充质干细胞 (MSC) 是一项复杂的工作，因为没有实验室普遍采用的标准化最佳培养条件。板密度、培养时间和培养基成分等因素极大地影响 MSC 的最终特性，使不同制造中心之间的产品比较变得复杂。这种变异性也使各种临床研究中 MSC 安全性和有效性结果的外推变得复杂。

起始文化材料

根据组织来源，间充质干细胞 (MSC) 的收集和分离涉及多种技术。

骨髓间充质干细胞

骨髓通常因其丰富而受到青睐，但需要在 24 小时内进行侵入性采集和处理。虽然低温保存显示出希望，但还需要进一步的研究来充分评估其影响。

脐带来源的 MSC

脐带来源的间充质干细胞在效力方面具有优势，可以通过外植体或酶促方法获得。脂肪组织具有高干细胞产量，通过抽脂获得并使用酶促或机械方法进行处理。

脂肪来源的间充质干细胞

与骨髓来源的 MSC 相比，脂肪来源的 MSC 表现出更高的稳定性和增殖率。

遵守监管标准和验证程序对于确保整个制造过程的质量和安全至关重要。

优化培养条件和扩张

为了使 MSC 实现最佳增殖，它们必须粘附在培养物表面并在不超过 80% 汇合的情况下生长，从而防止因细胞与细胞接触而产生的抑制。适当的接种密度对于避免连续过早传代或过度长期培养至关重要，这两者都可能导致衰老或遗传不稳定。

自动化细胞培养大规模生产贴壁细胞可以显着降低劳动力成本并提高细胞质量，这对于扩大工艺规模至关重要。与传统方法相比，利用生物反应器可以更频繁地补料培养物，确保维持对细胞生长至关重要的代谢物水平，从而实现更快、更健康的 MSC 扩增。

氧气浓度注意事项

氧气浓度是 MSC 培养的关键因素。在天然的低氧环境中，MSC 主要依靠无氧糖酵解来产生 ATP，以避免氧化损伤。然而，MSC 在培养中的扩增通常在常氧条件 (21% O2) 下进行，氧含量比其自然生理环境高 4-10 倍，迫使 MSC 从无氧糖酵解转变为线粒体氧化磷酸化，可能损害细胞功能。

虽然在缺氧和常氧条件下培养 MSC 不会影响其免疫表型特征或可塑性，但确实会影响其形态、复杂性和线粒体活性。尽管存在这些担忧，大多数间充质干细胞目前都是在含氧量正常的条件下培养的。转为缺氧的合理性需要进一步验证，以确保其有利于 MSC 的扩张和功能。

媒体优化

添加胎牛血清 (FBS) 的 Alpha-MEM 或 DMEM 是常用培养基，但 FBS 的免疫学和感染性缺点促使人们对开发用于大规模 MSC 扩增同时保持其特性的血清替代品和无血清培养基产生兴趣。研究表明，用来自供体脐带血的活化的富含血小板血浆培养的 UC-MSC 比用标准 FBS 培养的 UC-MSC 表现更好。

质量控制和安全

确保间充质干细胞的质量和安全涉及多个层面的控制：从原材料的选择到过程中的测试和最终产品的放行。遵守国际协调委员会 (ICH) 指南和良好生产规范 (GMP) 标准至关重要。

关键质量属性包括细胞活力、细胞身份、纯度、效力和遗传稳定性，免疫表型和核型分析等技术对于表征至关重要。

必须在包装前或制造过程的最后阶段进行安全研究，包括微生物测试。过程中测试发生在关键生产步骤，例如更改存储介质。微生物学测试可检查欧洲药典中规定的需氧和厌氧细菌、真菌、支原体和细菌内毒素。

用于 MSC 生产的细胞库

建立细胞库对于优化细胞培养产量至关重要。根据欧盟 ATMPs-GMP，细胞库可分为：

• 主细胞库 (MCB)：这是在特定条件下从选定的细胞群中获得的经过彻底表征的细胞培养物。这些细胞在一次操作中被分配到容器中，经过处理以确保均匀性，并储存以保证稳定性。
• 工作细胞库 (WCB)：这种细胞培养物源自主细胞库。通过一次操作将细胞分配到容器中，进行处理以确保均匀性，并储存以保持稳定性。 WCB 用于在临床和商业生产过程中制备细胞培养物。

MCB 和 WCB 的两层系统允许从小的初始群体进行大规模细胞扩增。该系统对于同种异体 MSC 应用特别有效，可确保临床使用细胞的一致和高质量供应。

冷冻保存和储存

冷冻保存技术已十分成熟，其中二甲亚砜 (DMSO) 是最常用的冷冻保护剂。为了防止交叉污染，最佳储存条件要求温度低于 -120°C，通常在液氮气相中实现。冷冻程序通常涉及受控速率冷冻，以确保最佳的冷冻保存结果。通过有效的标签和存储库存系统保持强大的可追溯性对于保持细胞完整性至关重要。

解冻后及临床应用

解冻后，MSC 必须进行最终表征，包括活力、恢复、表型和效力测定。快速解冻至关重要，在临床应用前培养细胞进行额外传代可以增强治疗潜力。

在临床应用中，MSC 通常通过外周静脉或中心静脉管线以 2-5 ml/min 的慢速输注。然而，在已发表的试验中，通常缺乏有关血管内输注过程中细胞处理的详细信息。对于骨髓源性 MSC (BM-MSC)，最好不要使用过滤器或抗反流帽，而对于脂肪组织源性 MSC (ADSC)，通常采用 200 微米输注过滤器来防止结块。关于皮下储存器或塑料导管的使用存在争议，因为它们可能保留细胞，需要在输注后用盐水溶液冲洗。

处理活干细胞产品时常见的临床错误包括

• 剧烈摇动细胞瓶，可能因摩擦而导致细胞死亡
• 偏离储存温度导致细胞衰老或凋亡
• 细胞沉淀快速重悬，导致质膜破裂并随后聚集
• 仓促注射细胞导致细胞因针摩擦而死亡。

结语

完善临床用途的 MSC 扩增需要对培养条件进行细致的管理、严格的质量保证和熟练的冷冻保存方法。随着技术的不断进步，建立标准化方案变得势在必行，以维护不同临床环境中间充质干细胞疗法的安全性、有效性和一致性。

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案例

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