마우스는 일반적으로 인간 질병 연구를 위한 포유동물 모델로 사용됩니다. 그들은 작고 비용 효율적이며 빠르고 쉽게 번식할 수 있습니다. 그들은 생물학적으로나 유전적으로 인간과 유사하며 가장 중요한 것은 마우스 유전자가 쉽게 조작될 수 있다는 것입니다.

녹아웃 마우스를 연구하는 이유는 무엇입니까?

A 녹아웃 마우스 기존 유전자를 대체하거나 파괴하기 위해 인공 DNA 서열을 도입함으로써 특정 유전자가 비활성화되거나 "녹아웃(knock out)"되는 유전자 변형 마우스입니다. 유전자의 활성을 제거하면 유전자의 기능에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. 녹아웃 마우스는 암, 당뇨병, 비만, 심혈관 질환, 신경 퇴행성 질환 및 노화를 포함한 다양한 종류의 인간 질병을 연구하고 모델링하는 데 유용합니다.

녹아웃 마우스는 어떻게 만들어지나요? 

유전자의 전체 길이 야생형 서열의 번역을 방지하기 위한 목적으로 배아 줄기(ES) 세포 및 클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(CRISPR)과 같은 녹아웃 마우스 모델을 만드는 여러 전략이 있습니다. 

배아줄기세포를 이용한 유전자 표적화

ES 세포의 상동 재조합은 큰 게놈 영역의 특정 유전자 표적화를 위한 강력한 방법입니다. 이것은 상동 재조합 벡터를 사용하여 관심 있는 특정 유전자에 외래 DNA 서열을 직접 삽입함으로써 달성됩니다. 외래 DNA 서열은 비활성이며 삽입이 성공적으로 도입된 세포를 스크리닝하는 데 도움이 되는 "리포터 유전자"를 포함합니다. 변형된 ES 세포는 배반포에 주입되어 키메라 마우스로 발달하는 키메라 배아를 형성합니다. 그런 다음 키메라 생쥐는 야생형 생쥐와 교배되어 자손에게 변형된 유전 물질의 생식선 전달을 보장합니다.

CRISPR/Cas9 기술

CRISPR 게놈 편집 시스템은 관심 있는 작은 DNA 서열을 표적으로 하는 RNA 유도 엔도뉴클레아제 시스템입니다. 가이드 RNA(gRNA)와 Cas9 엔도뉴클레아제가 있는 경우 gRNA는 Cas9 엔도뉴클레아제가 특정 위치에서 DNA를 절단하도록 지시하여 유전자에 indel을 생성하고 프레임시프트 돌연변이를 유도하여 구성적 녹아웃을 생성합니다. gRNA와 Cas9는 배아에 주입된 후 수양모에 이식되어 창립자를 생성합니다. 그런 다음 파운더를 스크리닝하고 사육하여 녹아웃 대립유전자를 보유하는 F1 마우스를 얻습니다.

CRISPR/Cas 9 기술은 녹아웃 마우스 모델을 생성하고 얻는 간단하고 빠른 방법입니다. 이는 표적 벡터 구성, ES 세포 선택 및 표적 클론의 검증 및 적어도 하나의 클론에서 생식선 전달을 달성하는 데 수개월의 시간이 소요되는 ES 세포에서 유전자 표적을 사용하는 기존의 방법보다 훨씬 빠릅니다. 

녹아웃 마우스의 제한 사항

녹아웃 마우스에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 유전자 녹아웃의 약 15%는 발달적으로 치명적이며, 이는 유전적으로 변경된 배아가 성체 마우스로 성장할 수 없음을 의미합니다. 어떤 경우에는 유전자가 발생 단계와 성인기에 다른 역할을 합니다. 또한, 발달 중 유전자 활성의 손실은 성인 상태에서 유전자의 역할을 가릴 수 있습니다. 이러한 제한 중 일부는 대상 유전자가 특정 조직에서 비활성화되거나 마우스가 관심 유전자를 비활성화하기 전에 성체 상태로 발달할 수 있도록 유도할 수 있는 조건부 녹아웃의 사용을 통해 극복할 수 있습니다.  

Knockout All 프로젝트 - 포괄적인 마우스 리소스

2019년, GemPharmatech는 녹아웃 올 프로젝트(KOAP) 5년 이내에 마우스 게놈의 모든 단백질 코딩 유전자에 대한 녹아웃 또는 조건부 녹아웃 마우스 균주를 생성하려는 야심과 함께. KOAP는 높은 처리량의 CRISPR 기반 유전자 편집 전략을 통해 마우스 모델을 생성하며 매년 약 6000개의 돌연변이 균주를 생성할 수 있습니다. 지금까지 거의 10,000개 이상의 유전자가 표적이 되어 종양학, 자가면역, 대사 및 신경변성을 포함한 광범위한 연구 분야에 20개 이상의 사용 가능한 녹아웃 및 조건부 녹아웃 마우스 모델을 제공합니다.  

Cre 재조합효소를 발현하는 형질전환 마우스는 조건부 녹아웃 마우스의 생성에 필요합니다. GemPharmatech는 199 마우스 계통 면역계, 신경계, 뼈, 근육 및 지방세포, 위장관, 심혈관계, 생식계 등과 같은 특정 조직에서 Cre 재조합효소를 발현합니다. KOAP 마우스는 C57BL/6 배경 균주에서 생성됩니다. 마찬가지로 Cre 라인도 C57BL/6 배경 균주에서 생성되어 KOAP에서 생성된 플록스 균주로 번식하여 조건부 녹아웃 마우스를 생성하는 것이 가능합니다. 마우스에서 더 높은 수준으로 발현하는 것으로 입증된 iCre(Codon-Improved Cre Recombinase)는 대부분의 GemPharmatech Cre 라인에 사용되어 고효율 절제가 가능했습니다.

바로 사용 가능한 녹아웃 모델

유전자 조작 마우스 모델의 선두주자인 GemPharmatech는 KOAP를 통해 가장 큰 CRISPR 마우스 균주 컬렉션을 만들어 연구원들에게 인간 질병을 연구하는 데 유용한 마우스 리소스를 제공할 계획입니다. 

우리는 과학자들과 연구원들이 방대한 라이브러리를 확인할 것을 적극 권장합니다. 마우스 리소스. 원하는 관심 유전자를 사용할 수 없는 경우 걱정하지 마십시오. 빠르면 3-6개월 내에 생성할 수 있습니다.

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참조

Ju, C., Liang, J., Zhang, M. et al. 돌연변이 쥐를 위한 국립 자원 센터의 쥐 자원. 맘 게놈 33, 143-156 (2022). https://doi.org/10.1007/s00335-021-09940-x