요약

HRM 분석은 유전적 변이 분석을 위한 신뢰할 수 있고 효율적인 접근 방식입니다. 적응성, 감도 및 비용 효율성은 의료 유전학, 암 연구, 미생물학 및 식물 유전학을 포괄하는 다양한 영역에서 유전적 변이를 식별하고 특성화하는 데 귀중한 자산이 됩니다. 기술 발전이 지속되고 응용 분야가 확대됨에 따라 HRM 분석은 분자 진단 분야에서 중추적인 역할을 계속할 준비가 되어 있습니다. 지속적인 기여는 맞춤형 의학의 발전을 촉진하여 궁극적으로 환자 결과를 향상시킬 것으로 예상됩니다.

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HRM(고해상도 용융) 분석은 DNA 서열의 변이를 구별하기 위해 분자 생물학에서 사용되는 PCR 후 기술입니다. PCR 산물의 녹는 거동을 기반으로 하는 간단하고 빠른 방법입니다. 이는 DNA 샘플에서 단일 염기 다형성(SNP) 또는 돌연변이와 같은 유전적 변이를 검출하는 데 특히 유용합니다. HRM 분석은 유전형 분석, 돌연변이 스캐닝, 메틸화 분석 등 다양한 응용 분야에 자주 사용됩니다.

HRM 분석이 특히 유리한 이유는 무엇입니까?

HRM 분석은 시퀀싱 및 Taqman SNP 타이핑과 같은 대체 유전형 분석 기술에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 특히 이는 보다 비용 효율적인 솔루션이므로 대규모 유전형 분석 프로젝트에 특히 적합합니다. 높은 감도로 단일 염기 변화도 감지할 수 있습니다. 작업 흐름이 빨라서 짧은 시간 내에 광범위한 샘플 세트의 정확한 유전형 분석이 가능합니다. 이 간단한 분석은 특정 프로브 또는 PCR 후 처리 단계가 필요하지 않으며 HRM 가능 실시간 PCR 기계가 장착된 모든 실험실에서 수행할 수 있습니다.

HRM 분석 작동 방식에 대한 간략한 개요는 다음과 같습니다.

이 과정은 일반적으로 이중 가닥(dsDNA) 결합 염료가 있는 관심 돌연변이가 있는 표적 DNA 영역의 PCR 증폭으로 시작됩니다. 이 결합 염료는 dsDNA에 부착되면 높은 형광을 나타내고 결합되지 않으면 낮은 형광을 나타냅니다. 증폭 후 생성된 앰플리콘은 점진적인 온도 상승을 거쳐 dsDNA 가닥이 분리(용융)됩니다. 온도가 상승하면 DNA가 변성되고 dsDNA가 단일 가닥으로 변형됩니다. 이러한 분리가 발생하면 dsDNA에 결합된 염료에서 방출되는 형광이 점차 감소합니다.

결과는 앰플리콘의 특징적인 용융 곡선 프로파일입니다. HRM 분석에서 "고해상도"라는 용어는 온도 상승 중 형광 변화를 정밀하게 모니터링하는 것과 관련이 있습니다. DNA 용융 프로파일은 감도가 높아져 캡처되므로 DNA 서열의 용융 거동에서 미묘한 차이를 감지할 수 있습니다. 기록된 용융 곡선을 분석하여 DNA 서열의 변화를 식별합니다.

돌연변이나 다형성은 DNA의 녹는 특성에 영향을 줄 수 있습니다. 샘플의 용융 곡선을 알려진 참조 샘플과 비교 분석하면 유전적 변이의 존재를 밝힐 수 있습니다.

EvaGreen® 염료로 HRM 분석 우수성 향상

성공적인 HRM 분석을 위해서는 dsDNA 결합 염료의 포화 농도가 필수적이며 PCR을 억제하지 않는 균형을 유지해야 합니다. dsDNA에 결합된 형광 염료의 양은 앰플리콘 길이, 구성, PCR 조건과 같은 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 이상적으로 최적의 염료 농도를 결정하려면 적정 실험을 통한 경험적 테스트가 필요합니다.

EvaGreen® 염료 HRM 분석을 위한 탁월한 선택입니다. 이 녹색 형광 핵산 염료는 dsDNA에 결합될 때 플루오레세인(FAM) 또는 SYBR® 염료 Green I과 스펙트럼이 유사하므로 염료는 488nm 아르곤 레이저 또는 해당 영역의 파장을 사용하는 모든 가시광선 여기가 장착된 장비와 쉽게 호환됩니다. . EvaGreen® 염료는 뛰어난 열 및 가수분해 안정성을 자랑하며 일상적인 취급이 편리합니다.

본질적으로 형광성이 없는 EvaGreen® 염료는 dsDNA에 결합하면 형광성이 높아집니다. 돌연변이 유발성이 없고 세포독성이 없으며 세포막에 대한 불투과성은 세포에 빠르게 들어가는 돌연변이 강화제인 SYBR Green I과 차별화됩니다.

EvaGreen® 염료의 독특한 특성으로 인해 이 염료는 정량적 실시간 PCR(qPCR) 응용 분야 및 HRM 분석에서 핵심 역할을 담당하게 되었습니다. 널리 사용되는 SYBR Green I과 비교하여 EvaGreen® 염료는 PCR에 대한 억제력이 덜하고 비특이적 증폭을 일으키는 경향이 적습니다. 이러한 장점을 통해 EvaGreen® 염료를 더 높은 농도로 사용할 수 있어 더욱 강력한 PCR 신호와 고해상도 DNA 용융 분석이 가능해집니다.

*참고: HRM은 Idaho Technologies, Inc./BioFire Defense, LLC의 등록 상표입니다.

HRM 분석을 위한 응용 프로그램은 무엇입니까?

HRM 분석은 분자 생물학 및 유전학의 다양한 분야에 걸쳐 응용 프로그램을 찾습니다. 다음은 몇 가지 일반적인 응용 프로그램 목록입니다.

유전자형:

HRM 분석은 DNA 샘플 내에서 SNP, 삽입, 삭제 또는 가닥 상보성(예: 이형접합성 또는 동형접합성 물질)과 같은 유전적 변이를 식별하는 것과 관련된 유전형 분석에 널리 사용됩니다. 이를 통해 연구자들은 용융 프로필을 기반으로 서로 다른 대립유전자 또는 유전자형을 구별할 수 있습니다.

돌연변이 스캐닝:

HRM 분석은 돌연변이 또는 서열 변이의 존재 여부를 알아보기 위해 큰 DNA 영역이나 유전자 패널을 스크리닝하는 데 사용되는 프로세스인 돌연변이 스캐닝을 용이하게 합니다. 이를 통해 연구자들은 질병이나 유전 질환과 연관될 수 있는 잠재적인 돌연변이를 효율적으로 식별할 수 있습니다. 이는 암과 관련된 돌연변이를 검출하기 위해 종양 샘플의 유전적 변형을 프로파일링하는 데 종종 사용됩니다.

메틸화 분석:

시토신 잔기에 메틸기가 추가되는 DNA 메틸화는 유전자 조절 및 후생적 변형에 중요한 역할을 합니다. 메틸화된 DNA와 메틸화되지 않은 DNA는 바이설파이트 처리 후 서로 다른 서열을 획득하여 현저하게 다른 용융 프로필을 갖는 PCR 산물을 생성합니다. HRM 분석은 메틸화 및 비메틸화 DNA 서열의 용융 거동을 평가하여 DNA 메틸화 패턴을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. PCR 반응 생성물의 서열을 분석하여 DNA 메틸화의 특정 위치를 밝힐 수도 있습니다.

최근 간행물에서 분자암, 김 외. 무세포 DNA(cfDNA)에서 간세포암(HCC) 진단을 위한 메틸화 민감성 고해상도 분석(MS-HRM) 분석법을 도입했습니다. 이 MS-HRM 방법을 적용해 액체생검 시료에서 간세포암종을 성공적으로 식별해 알파태아단백질(AFP) 검사 성능을 뛰어넘는 성과를 거뒀다. 이러한 결과는 HCC의 진단 검출을 위한 간단한 PCR 기반 기술의 잠재적인 사용을 시사합니다.

병원체 검출:

HRM 분석은 바이러스, 박테리아 및 곰팡이를 포함한 병원체의 검출 및 식별에 사용됩니다. 특정 게놈 영역이나 보존된 서열을 표적으로 삼아 HRM은 다양한 병원체 균주를 구별하거나 임상 또는 환경 샘플에서 감염원의 존재를 감지하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

최근 간행물에서 분석 화학, 이페이웨이 et al. 향상된 단일 세포 분해능을 위해 EvaGreen® Dye를 활용하는 기존 접근 방식의 기능을 능가하는 디지털 PCR과 HRM® 기술을 완벽하게 결합하는 혁신적인 방법을 도입했습니다. 저자는 이 새로운 워크플로우를 성공적으로 구현하여 박테리아 식별 정확도가 크게 향상된 디지털 PCR-HRM 분석을 만들었습니다. 이 획기적인 발전은 박테리아 식별에 대한 이해를 향상시킬 뿐만 아니라 광범위한 감염성 질환을 대상으로 하는 미래의 디지털 PCR-HRM 분석법 개발을 위한 발판을 마련합니다.

식물 유전학 및 육종:

식물 유전학 및 육종 프로그램에서 HRM 분석은 마커 지원 선택, 유전자 매핑 및 다양성 분석에 사용됩니다. 이는 연구자들이 질병 저항성, 수확량 또는 품질 특성과 같은 바람직한 특성과 관련된 유전적 변이를 식별하고 특성화하는 데 도움이 됩니다.

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참조 :

Erali M, Voelkerding KV, Wittwer CT. 임상병리의학을 위한 고해상도 용융 응용 분야입니다. Exp Mol Pathol. 2008;85(1):50-58. doi:10.1016/j.yexmp.2008.03.012

Garritano S, Gemignani F, Voegele C, 외. TP53 유전자좌에서의 SNP 유전형 분석 및 돌연변이 스캐닝을 위한 고해상도 용융 분석의 효율성 결정. BMC 제넷. 2009;10:5. 2009년 17월 10.1186일 게시. doi:1471/2156-10-5-XNUMX

김SC, 김동우, 조은진 외. 간세포 암종 검출을 위한 순환 무세포 DNA 메틸화 시그니처. 몰 암. 2023;22(1):164. 2023년 6월 10.1186일 게시. doi:12943/s023-01872-1-XNUMX

이 PW, Chen L, Hsieh K, Traylor A, Wang TH. 박테리아의 정확한 식별을 위해 디지털 용융 곡선의 가변성을 활용합니다. 항문 화학. 2023;95(42):15522-15530. doi:10.1021/acs.analchem.3c01654

Ohta T, Tokishita S, Yamagata H. Ethidium bromide 및 SYBR Green I은 대장균에서 UV-doi:10.1016/s1383-5718(01)00155-3조사 및 화학적 돌연변이 유발물질의 유전독성을 향상시킵니다. 돌연변이 입술. 2001;492(1-2):91-97. doi:10.1016/s1383-5718(01)00155-3

리드 GH, 켄트 JO, Wittwer CT. 간단하고 효율적인 분자 진단을 위한 고해상도 DNA 용융 분석. 약물유전체학. 2007;8(6):597-608. 도이:10.2217/14622416.8.6.597

보센 RH, Aten E, Roos A, 덴 Dunnen JT. 고분해능 용융 분석(HRMA): 단순한 서열 변형 스크리닝 그 이상입니다. 흠 무타트. 2009;30(6):860-866. doi:10.1002/humu.21019 Wojdacz TK, Dobrovic A. 메틸화에 민감한 고분해능 용융(MS-HRM): 메틸화의 민감하고 높은 처리량 평가를 위한 새로운 접근 방식입니다. 핵산 해상도. 2007;35(6):e41. doi:10.1093/nar/gkm013