那么，AAV 到底是什么？

腺相关病毒 (AAV) 于 1965 年首次被发现 鲍勃·阿奇森和华莱士·罗，他们在腺病毒样本中观察到它们是复制缺陷的颗粒。属于 依赖细小病毒 属内的 细小病毒科 在 AAV 家族中，AAV 的独特之处在于它们需要依靠辅助病毒（如腺病毒或单纯疱疹病毒）来完成复制。在没有辅助病毒的情况下，AAV 会在宿主细胞中保持休眠状态而不会引起疾病，因此对于基因传递应用而言，它们非常安全。

在野生型中，AAV 可以在 Rep 蛋白的引导下整合到人类 19 号染色体 (AAVS1) 上的特定位点。然而，重组 AAV (rAAV) 的设计中没有 Rep，因此在细胞内保持稳定、非整合的存在。rAAV 的这种游离性质将插入诱变（外源 DNA 序列与宿主生物基因组整合时引起的突变）的风险降至最低，从而提高了其在基因治疗中的安全性。AAV 也非常小，直径约为 25 纳米，基因组大小仅为 4.7 千碱基 (kb)，使其成为将基因转移到各种细胞类型的理想选择。

和他们的 安全概况, 低免疫原性和 灵活地针对特定组织，AAV 已成为基因治疗和研究的主要工具，推动了遗传和获得性疾病治疗的进步。

AAV 作为载体的关键特征

AAV 具有多种独特的特性和组件，使其成为研究和治疗应用的宝贵载体。

AAV 基因组和成分

AAV 基因组是一个约 4.7 kb 的小型单链 DNA (ssDNA) 分子，由两个必需的开放阅读框 (ORF) 组成：

1. 复制基因（声望) 编码四个非结构复制基因的 ORF
2. 衣壳基因（帽) 编码三个结构衣壳基因的 ORF。

额外的 ORF 帽 基因，编码膜相关辅助蛋白（MAAP）和组装激活蛋白（AAP），虽然功能仍不清楚。

AAV 的主要特点包括：

• 倒置末端重复序列 (ITR)： AAV 基因组两端各有 145 个碱基的 ITR，在 AAV 复制中起着关键作用。这些重复序列可实现碱基配对，从而实现互补 DNA 链的合成。
• 代表基因： Rep 基因编码 AAV 生命周期所必需的蛋白质，包括 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40，它们是复制和包装所必需的。
• 帽基因： Cap 基因编码以 1:2:3 的比例形成病毒衣壳的三种衣壳蛋白（VP1、VP1 和 VP10），使 AAV 能够靶向特定组织。

对于基因治疗应用，感兴趣的转基因被插入到 AAV 转移质粒的两个 ITR 之间。在生产过程中，Rep 和 Cap 基因以反式形式单独提供。

AAV 辅助病毒要求

作为一种无法复制的病毒，AAV 需要辅助病毒或辅助质粒来激活。辅助质粒提供介导 AAV 复制所需的腺病毒基因——E4、E2a 和 VA。在实验室环境中，AAV 转移质粒（含有转基因）、Rep/Cap 质粒和辅助质粒共转染到 HEK293 细胞中，该细胞还提供腺病毒 E1 基因以产生传染性 AAV 颗粒。

基因治疗的 AAV 血清型和组织趋向性

AAV 的血清型具有显著的多样性，每种血清型都有独特的组织趋向性，这意味着它们对特定细胞类型和组织有天然偏好。这种多样性使科学家能够选择合适的 AAV 血清型来针对特定的组织或器官，这对于基因治疗和研究应用都至关重要。

AAV 血清型之间的天然衣壳变异会影响每种血清型与某些细胞受体的结合效果，最终影响哪些组织最有效地传导。通过选择适当的血清型，研究人员可以增强转基因向目标组织的传递，同时最大限度地减少脱靶效应。

AAV 为基因治疗提供了许多优势，包括：

1. 安全概况：AAV 无致病性，且免疫原性低，降低了不良免疫反应的风险。
2. 长期基因表达：它们促进治疗基因的长期表达，对慢性病有益。
3. 组织趋向性：它们的多种血清型允许选择性地输送到特定组织，从而增强治疗效果。
4. 最小限度插入诱变：AAV 通常保持染色体外状态，从而最大限度地降低致癌转化的风险。

以下是一些最常用的 AAV 血清型及其首选组织目标的概述：

在设计基于 AAV 的疗法或研究时，血清型的选择至关重要，因为它直接影响基因传递的有效性和安全性。例如：

• AAV8 和 AAV9 由于其在肝脏和肌肉组织中的高转导效率，经常被选用于肝脏和肌肉应用。
• AAV9其穿过血脑屏障的能力扩大了其在脊髓性肌萎缩症（SMA）和某些类型的肌营养不良症等神经系统疾病的基因治疗中的应用。
• AAV2 由于其对视网膜层具有极好的穿透性，经常用于眼部基因治疗，特别是视网膜疾病。

通过利用每种 AAV 血清型的独特趋向性，科学家可以设计出针对特定组织的载体，从而实现精准基因传递，并最大程度地减少非目标组织中的潜在副作用。此外，衣壳工程和假型化（将一种血清型的衣壳与另一种血清型的衣壳互换）进一步完善了这些靶向能力，为更广泛的治疗和研究应用打开了大门。

AAV 的作用机制

AAV 的作用机制涉及几个关键步骤，从进入宿主细胞到治疗基因的表达。了解此过程对于优化 AAV 的基因治疗应用至关重要。以下是 AAV 功能的详细概述：

1. 进入宿主细胞： AAV 主要通过受体介导的内吞作用进入宿主细胞，这使得它们能够与细胞表面的特定受体结合。这种相互作用通常涉及 AAV 上的病毒衣壳蛋白与受体结合，例如硫酸肝素蛋白聚糖、AAV 受体 (AAVR) 和其他细胞因子。这种结合触发病毒的内化，导致其进入细胞质。
2. 内体逃逸： 一旦进入细胞，AAV 就会被包裹在内体中。要启动下一阶段，AAV 必须逃离内体隔室。这种逃离可以通过衣壳中 pH 依赖性变化来实现，这种变化会导致内体膜融合肽暴露，从而使 AAV 能够将其基因组释放到细胞质中。
3. 运输至细胞核： 逃离内体后，AAV 将其 ssDNA 基因组运送到细胞核。此步骤由核孔复合体促进，核孔复合体允许小颗粒通过。
4. 基因组转化和基因表达： 在细胞核中，由于宿主细胞的 DNA 修复机制，AAV 基因组从单链形式转变为双链 DNA 形式。然后，这种双链 DNA 可以作为附加体存在于细胞核中，或者在野生型 AAV 的情况下，通过 Rep 蛋白的作用，整合到 1 号染色体 AAVS19 位点的宿主基因组中。
   • 对于通常缺乏 Rep 的重组 AAV，双链 DNA 仍保持游离状态，从而允许转基因稳定表达而无需整合。这种游离性质提供了一定程度的免疫监视保护，从而实现了持续的治疗效果。
5. 转基因表达： 一旦 AAV 基因组被转化并稳定下来，插入 ITR 之间的转基因就可以转录并翻译成相应的蛋白质。这种蛋白质的产生取决于转移质粒中整合的调控元件。例如，使用强启动子可以导致高水平的转基因表达，而组织特异性启动子可以确保在特定细胞类型中进行靶向表达。

用于基因治疗的 AAV 载体

基因疗法通过改变基因表达或改变细胞和组织功能来治疗疾病，包括基因替换、失活或引入新基因等技术。AAV 已成为基因治疗最有效的载体之一，为一系列遗传和后天疾病提供了有希望的解决方案。它们的独特特性（例如低致病性、稳定性和靶向组织趋向性）使 AAV 特别适合将治疗基因递送到特定细胞。这种潜力已导致在治疗以前难以治愈的疾病方面取得重大突破，基于 AAV 的疗法成为首批获得 FDA 批准的基因疗法之一。

以下是 FDA 批准的主要基于 AAV 的基因疗法以及适合 AAV 疗法的疾病类型的概述。

FDA 批准的基于 AAV 的基因疗法

基于 AAV 的基因疗法在临床环境中已取得显著成功，促使 FDA 批准多项针对罕见和危及生命的疾病的疗法：

• 莱伯先天性黑蒙（LCA）： 勒克斯图纳 （voretigene neparvovec-rzyl）是首批获得 FDA 批准的基于 AAV 的基因疗法之一，通过提供 RPE65 基因的功能性副本来治疗 LCA。LCA 是一种罕见的遗传性疾病，会导致严重的视力障碍或出生失明。临床试验表明患者的视力有显著改善，凸显了 AAV 在治疗遗传性失明方面的变革潜力。

• 脊髓性肌萎缩症（SMA）： 佐尔根斯玛 (onasemnogene abeparvovec-xioi) 使用 AAV9 将 SMN1 基因的功能性拷贝传递给 SMA 患者，SMA 是一种影响运动神经元的严重遗传病，可导致肌肉无力和早期死亡。Zolgensma 已证明可显著改善被诊断为 SMA 的婴儿的运动功能并延长其生存期。

• 血友病： 血友病基因疗法利用 AAV 载体来促进凝血因子的产生，其中几种基于 AAV 的治疗方法取得了良好的效果。 亨吉尼克斯 和 拜克韦兹 使用 AAV 载体将 IX 因子递送至血友病 B 患者，同时 罗克塔维亚是一种基于 AAV5 的疗法，已证明 A 型血友病患者能够持续表达凝血因子 VIII。这些疗法为血友病管理带来了重大进步，减少了频繁注射凝血因子的需要。

• 杜氏肌营养不良症（DMD）： 埃莱维迪斯 (delandistrogene moxeparvovec-rokl) 治疗 DMD，这是一种严重的遗传性疾病，会导致肌肉逐渐无力和退化。通过提供改良版的肌营养不良蛋白基因（微肌营养不良蛋白），Elevidys 有助于恢复部分肌肉功能，弥补功能性肌营养不良蛋白的缺乏，为 DMD 患者带来新希望。

适合 AAV 治疗的疾病类型

AAV 疗法正在针对多种疾病适应症进行开发，尤其是神经系统、眼科、代谢、神经肌肉和心血管疾病。这些类别中的每一个都为靶向基因治疗提供了独特的机会。

• 神经系统疾病： AAV 正在用于治疗帕金森病和亨廷顿病等与神经退行性疾病有关的疾病。AAV 能够将治疗基因直接递送至中枢神经系统，从而实现持续表达，有可能改变疾病进展并改善患者治疗效果。

• 眼科疾病： AAV 疗法在治疗遗传性视网膜疾病方面已显示出良好的前景，例如莱伯氏先天性黑蒙和视网膜色素变性。这些疾病通常源于特定的基因突变，因此成为旨在恢复视力的基因替代疗法的理想候选者。
• 代谢疾病： 人们正在研究 AAV 治疗代谢疾病（如苯丙酮尿症 (PKU) 和威尔逊氏病）的潜力。通过传递纠正代谢途径的基因，这些疗法可以帮助控制甚至逆转这些遗传疾病的影响。

• 神经肌肉疾病： SMA 和 DMD 等疾病是 AAV 基因疗法的主要目标。这些疾病通常是由对肌肉功能至关重要的基因突变引起的，而 AAV 可以促进促进肌肉健康和功能的治疗基因的传递。

• 心血管疾病： AAV 也正在被应用于心脏病领域，它们可用于传递增强心脏功能或预防有害过程的基因。这种方法有可能治疗一系列心血管疾病，从缺血性心脏病到心力衰竭。

转向更常见的疾病：

虽然最初的 AAV 疗法主要针对罕见疾病，但人们越来越有兴趣将这些方法扩展到更常见的疾病。随着研究的进展，目标是利用 AAV 技术治疗更广泛的疾病，解决更多患者群体中尚未满足的重大医疗需求。这种转变是由基因疗法的进步以及对 AAV 为罕见疾病和常见疾病提供持久治疗的潜力的日益了解推动的。

AAV 的挑战与局限性

AAV 在基因治疗方面具有巨大的潜力，但也有其局限性，研究人员和临床医生必须解决这些局限性：

• 预先存在的免疫力： 许多人体内已有针对常见 AAV 血清型的中和抗体，这是由于之前接触过野生型 AAV 所致。这会降低 AAV 介导的基因传递的有效性，尤其是在临床环境中。为了解决这个问题，研究人员使用患者筛查和血清型选择策略来最大限度地减少免疫干扰。
• 有限的转基因能力： AAV 载体的最大包装容量约为 4.7 kb，这限制了它们可以携带的治疗基因或有效载荷的大小。较大的治疗基因或复杂的基因构建体可能需要双 AAV 系统或其他方法来提高递送效率。
• 转导效率的变化： AAV 转导效率在所有组织和细胞类型中并不均匀，受血清型选择、给药途径和特定细胞受体存在的影响。研究人员必须针对每种应用仔细优化这些变量，以实现有效且有针对性的基因传递。
• 染色体稳定性： 虽然 AAV DNA 大部分仍为游离型，从而降低了插入诱变的风险，但这种游离型形式在分裂细胞中可能不太稳定，可能会影响长期治疗基因的表达。
• 潜在的遗传毒性: 尽管 AAV 通常表现出良好的安全性，但如果 AAV DNA 整合到宿主基因组中，仍然存在插入诱变的风险。这种整合可能导致致癌转化，因此需要进行彻底的安全性评估，尤其是对于长期治疗。
• 制造和质量控制： 推进 AAV 基因疗法的一个主要障碍在于制造和质量控制。当前的生产方法通常需要大型专业设施、高昂的劳动力成本和漫长的开发时间才能达到临床级 GMP 标准。学术实验室开发的传统方法难以扩大规模，批次间差异进一步使生产复杂化，可能影响安全性和有效性。确保高比例的完整功能性衣壳也具有挑战性，因为不一致的比例可能会稀释所输送的治疗剂量。此外，衣壳有时会包裹非预期或非治疗性的 DNA 序列，从而引发安全问题。产能限制、训练有素的专家短缺以及严格的监管标准进一步增加了生产一致、高质量 AAV 产品的复杂性和成本。

研究环境中的 AAV

AAV 不仅在基因治疗中发挥重要作用，而且在各种研究应用中也是宝贵的工具。它们能够精确高效地传递遗传物质，因此对于基因工程、转基因表达和创建基因敲除模型至关重要。此外，CRISPR 技术与 AAV 的结合正在彻底改变基因研究领域。

基因工程与转基因表达

AAV 在基因工程中被广泛使用，以促进转基因在 细胞/组织 和 体内 设置。研究人员利用 AAV 载体将新基因引入生物体，从而研究基因功能、蛋白质相互作用以及基因修饰对表型的影响。使用 AAV 进行转基因表达的好处包括：

• 高效能：AAV 可以传导多种细胞类型，从而导致高水平的转基因表达。
• 长期表达：一旦递送，转基因即可保留在宿主细胞核中的游离基因，从而实现持续表达，而不存在随机整合带来的风险。
• 最小免疫原性：AAV 通常被宿主生物很好地耐受，从而降低了可能损害研究结果的免疫反应的可能性。

这种能力促进了模拟人类疾病的动物模型的产生，为疾病机制和潜在的治疗干预提供了关键的见解。

基因敲除模型和 CRISPR 应用中的 AAV

AAV 在创建基因敲除模型以研究基因功能方面发挥着重要作用，它可以将 CRISPR/Cas9 等工具递送至特定基因靶标。敲除模型可让研究人员灭活基因，从而深入了解基因功能、基因相互作用和潜在治疗靶标。

通过将 AAV 与 CRISPR 技术相结合，研究人员可以递送 Cas9 和引导 RNA (gRNA) 以在目标基因处诱导双链断裂。修复过程中引入的错误有效地敲除目标基因，使研究人员能够研究其功能和影响。

AAV 和 CRISPR 之间的协同作用开辟了遗传研究的新领域，使生物体能够进行有针对性的高效基因编辑。这种组合具有以下几个优点：

• 靶向基因编辑： 针对特定组织设计的 AAV 可让研究人员将 CRISPR 组件精确地引导至感兴趣的部位，从而最大限度地减少脱靶效应。
• 多路复用能力： AAV 可以同时传递多个 gRNA，从而可以同时敲除或修改多个基因——这是研究复杂遗传性状或疾病的有效方法。
• 体内 应用： 使用 AAV 传递 CRISPR 组件 体内 促进生物体内的基因编辑，增进我们对基因功能的理解，扩大治疗发展的可能性。

通过敲除模型和基因编辑应用，AAV 与 CRISPR 技术相结合正在彻底改变基因研究并为新的治疗策略铺平道路。

综上所述

AAV 是基因治疗和基因研究的一个多功能且前景光明的平台。其独特的特性，例如长期基因表达、低免疫原性以及能够靶向多种组织，使其成为开发遗传疾病、神经系统疾病等新型疗法的基石。

随着研究的进展，AAV 与 CRISPR 等尖端技术的结合正在增强我们研究基因功能和开发有效治疗方法的能力。然而，与预先存在的免疫力、转基因容量限制、扩大 AAV 生产的复杂性以及潜在的基因毒性相关的挑战需要仔细考虑和持续研究以优化 AAV 应用。

通过应对这些挑战并利用 AAV 的优势，科学家和临床医生有望开辟新的途径来理解复杂的生物过程并开发创新的治疗策略。AAV 在研究和临床环境中的前景光明，有可能改变遗传医学的格局。

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