总结

MSC 培养的质量控制是成功癌症研究的基石，强调需要严格的标准和方案来保持纯度、活力和功能。通过实施全面的质量控制措施，研究人员可以确保基于 MSC 的肿瘤治疗和干预措施的可靠性、可重复性和转化潜力。随着癌症研究的不断进步，优先考虑 MSC 培养的质量控制对于释放这些非凡细胞抗击癌症的全部治疗潜力仍然至关重要。

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间充质干细胞 (MSC) 于 1966 年由 Friedenstein 及其同事首次发现，现已超越最初在骨髓中的认识，成为癌症研究和治疗的关键参与者。这些成纤维细胞样多能成体干细胞来源于骨髓、脂肪组织、脐带和牙髓等多种组织，表现出独特的能力，例如自我更新和分化成各种细胞谱系。随着该领域的进步， 国际细胞治疗学会 (ISCT) 制定了定义 MSC 的最低标准，强调其功能属性和表面标志物表达，特别是在癌症研究的背景下，其肿瘤靶向和免疫调节特性具有重大前景。

定义 MSC：ISCT 标准

根据 ISCT，MSC 的特点是 三个主要标准:

1. 塑料附着力：
   • 间充质干细胞必须在标准细胞培养条件下粘附在塑料表面。
2. 多能性：
   • 它们应该表现出分化成成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的能力 细胞/组织.
3. 表面抗原表达：
   • MSC 必须表达特定的表面抗原，如 CD73、CD90 和 CD105，同时缺乏谱系特异性标记物的表达，包括 CD11b/CD14、CD19/CD79α、CD34、CD45 和 HLA-DR。

MSC 培养质量控制 挑战和考虑

异质性和变异性

阻碍更广泛采用基于 MSC 的疗法的主要障碍之一是分离细胞固有的异质性。在不同的组织来源和生产过程中观察到生长潜力、分化能力和蛋白质表达谱的差异。这种异质性不仅使基于 MSC 的产品的标准化变得复杂，而且还影响其治疗效果和安全性。

MSC 的分离和培养扩增

临床程序利用细胞培养方法来扩增从特定组织来源获得的有限的原代间充质干细胞群，通过多次传代来扩增它们，以获得具有临床意义的细胞计数。由于缺乏普遍接受的 MSC 分离和扩增方案，导致 MSC 分离和扩增存在相当大的差异。 细胞/组织 跨研究实体的文化技术。这种变异性使不同研究结果的可比性变得复杂。

有效的扩增策略力求大幅增加细胞数量，同时保留 MSC 的治疗潜力。值得注意的是，随着时间的推移和连续传代，间充质干细胞表现出增殖率下降，最终达到以生长停止为特征的衰老状态。此外，延长培养时间可能会损害细胞的分化能力。

因此，建立标准化方案、优化培养条件并实施严格的质量控制措施对于保持不同批次的 MSC 属性和功能一致至关重要。

MSC文化 关键质量控制参数

细胞表面抗原（CD标记）的表达

ISCT 提出了一组阳性和阴性标记，使研究人员能够将 MSC 与骨髓室中的其他细胞区分开来。选择阴性标记物包括造血细胞表达的表面抗原，而选择阳性标记物是因为大多数造血细胞不存在这些表面抗原。

自 2006 年 ISCT 提出的标记发布以来，其他几个标记作为 MSC 标记已获得广泛接受。这种不断扩展的 MSC 相关标记物组合使研究人员能够同时验证多种 MSC 相关表面抗原的表达，从而增加对分离的 MSC 的识别和验证的信心。一些广泛使用的 MSC 标记包括 CD29、CD44、CD146、CD166、CD271 和 STRO-1。

标记表达分析通常使用流式细胞术进行，它可以揭示单个细胞的表型。多色流式细胞术使用户能够同时检查多个标记。此外，许多流式细胞仪都配备了细胞分选功能，可用于富集特定的 MSC 群体并从分析中去除死细胞。

细胞活力和增殖

收获的 MSC 的活力可以使用台盼蓝染色或 7-氨基放线菌素 D 进行评估（7-AAD）排除方法。为了立即应用 MSC 获得最佳临床结果并确保冷冻保存后可接受的活力，初级活力应超过 90%。

集落形成单位 (CFU) 测定是一种广泛认可的评估 MSC 自我更新能力的方法。该测定量化了 MSC 在组织培养塑料上的单层培养中以克隆形成密度接种时生成集落单位的效率。通常，MSC 的单细胞悬浮液在铺于培养板上之前要经过连续稀释。当菌落变得可见时，通常在第 8 或 10 天左右，用吉姆萨对菌落进行染色，然后进行计数。如今，采用 CFU-F 检测 细胞/组织 评估用于临床前研究和临床试验的 MSC 制剂的质量。

三系分化潜力

MSC 的特点是在特定条件下培养时具有分化成三种不同谱系的卓越能力：脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞。成功的分化可以通过对分化细胞进行谱系标记表达染色和/或通过评估细胞的功能来验证。三系分化的确认为MSC身份的验证提供了极好的证据。

1. 成骨分化：
   • 间充质干细胞可以定向分化为成骨细胞，这是一种负责骨形成和矿化的特殊细胞。成骨分化过程涉及成骨细胞产生矿化的细胞外基质。为了评估成骨分化，研究人员经常测量碱性磷酸酶 (ALP) 等特定标记物的活性，或利用茜素红 S 等染色技术来可视化钙沉积，表明成熟的骨形成。
2. 脂肪形成分化：
   • 当经历脂肪形成诱导条件时，间充质干细胞可以分化成脂肪细胞，即专门储存脂质的细胞。脂肪形成分化过程导致分化细胞内脂滴的积累。为了确认脂肪形成分化，通常采用油红 O 染色，以可视化脂质积累并确认脂肪细胞表型。
3. 软骨分化：
   • 间充质干细胞具有分化成软骨细胞的能力，软骨细胞是软骨组织中发现的主要细胞，负责产生软骨特异性细胞外基质成分。软骨分化对于软骨修复和再生应用至关重要。 Alcian Blue 等组织学染色剂经常用于检测糖胺聚糖的存在，确认软骨组织的形成并验证 MSC 的软骨分化潜力。

评估 MSC 效力和治疗潜力的功能测定

虽然 细胞/组织 MSC 分化为成骨、软骨和脂肪形成谱系是一个基本特征，基于 MSC 的疗法的临床开发需要建立效力测定。这些测定旨在评估与 MSC 的预期临床作用机制相一致的特定生物功能属性。以下是用于评估 MSC 功效和治疗效果的几种关键功能测定：

1. 免疫调节试验:
   • 鉴于间充质干细胞在免疫相关疾病和移植中的潜在应用，了解间充质干细胞的免疫调节特性至关重要。涉及 T 细胞等免疫细胞的共培养测定为 MSC 的免疫抑制作用提供了宝贵的见解，使研究人员能够评估其有效调节免疫反应的能力。
2. 迁移和归巢测定：
   • 间充质干细胞具有固有的迁移能力，使它们能够定位于特定的组织损伤部位或炎症微环境。 Transwell 迁移测定或伤口愈合测定为评估 MSC 迁移响应各种趋化因子或刺激提供了有效的平台，从而阐明它们的归巢潜力和组织靶向效率。
3. 血管生成测定：
   • 间充质干细胞的促血管生成特性对于增强组织再生和修复过程具有重要前景。体外管形成试验涉及间充质干细胞与内皮细胞的共培养，为评估间充质干细胞的血管生成潜力及其刺激新血管形成的能力提供了一个强大的平台，这是组织再生和伤口愈合的关键步骤。
4. 旁分泌活性测定：
   • 间充质干细胞通过分泌多种旁分泌因子发挥治疗作用，包括生长因子、细胞因子和细胞外囊泡。酶联免疫吸附测定 (ELISA) 或多重细胞因子测定等定量测定有助于对 MSC 分泌因子进行全面分析，从而深入了解其旁分泌活性和治疗潜力。
5. 机械性能：
   • 最近的研究还开始探索 MSC 的机械特性，例如它们的刚度和粘弹性特性，这可能会影响它们的行为和功能 体内。原子力显微镜 (AFM) 或流变学分析等先进技术提供了有关 MSC 机械特性的宝贵数据，有助于更全面地了解其生物学特性和治疗应用。

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参考资料

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