优化免疫荧光染色的 7 个技巧

优化免疫荧光染色的 7 个技巧

优化免疫荧光染色的 7 个技巧


免疫荧光 (IF) 染色是细胞生物学的一项基石技术,使研究人员能够以非凡的细节可视化和研究细胞结构和蛋白质。这种广泛的能力是通过标记有荧光团的特异性抗体的组合来实现的,这些荧光团可识别各种细胞制剂的不同类型组织中的特定抗原。然而,要在 IF 染色中获得最佳结果,需要仔细优化各种实验参数。在这篇博文中,我们将探讨在免疫荧光成像中获得最佳结果的关键技巧和最佳实践。

1. 确定 IF 染色固定方法

固定是 IF 染色、保护形态、防止自溶和保留抗原性的关键步骤。针对特定样品类型和抗原定制的固定剂和固定方法的优化对于在不影响抗原性的情况下实现固定至关重要。研究人员通常使用化学交联剂或有机溶剂来实现这些目标。

化学交联剂:

化学交联剂通过交联细胞蛋白质发挥作用,多聚甲醛 (PFA) 是 IF 染色中广泛使用的固定剂。然而,PFA 可能会通过醛交联损害某些靶标的抗原性。通常在室温下以 4% 的浓度使用 10-20 分钟,可能需要调整孵育时间、浓度和温度以实现最佳抗体结合。有时使用甘氨酸进行固定后洗涤来淬灭 PFA 并停止交联反应。

有机溶剂:

有机溶剂,如丙酮、甲醇或乙醇,通过使细胞脱水、使细胞成分变性和沉淀来发挥作用。虽然变性可能会暴露通常隐藏的表位,从而对某些抗体有利,但有机溶剂不能像交联剂那样有效地保留样品结构。这些溶剂可能很刺激,导致固定过程中脂质和可溶性蛋白质的损失,影响样品结构。因此,不建议将它们用于状态特异性抗体,例如磷酸化抗体和针对膜蛋白的抗体。有机溶剂对脂质的渗透作用加快了这一过程,节省了样品制备的时间。

表 1:不同的固定方法

固定剂类型固定剂影响优点缺点
化学交联剂甲醛通过蛋白质的游离氨基酸交联保留细胞形态 遗传编码荧光蛋白的理想选择  抗原交联自发荧光  
戊二醛通过蛋白质的游离氨基酸交联保留细胞形态 遗传编码荧光蛋白的理想选择抗原交联自发荧光  
有机溶剂甲醇蛋白质沉淀更快的程序透化细胞  对蛋白质表位产生负面影响 不适合荧光蛋白 可溶性分子和脂质分子的损失
丙酮蛋白质沉淀保存速度更快 不会丢失很多表位  不适合荧光蛋白 可溶性分子和脂质分子的损失

2. 确定使用哪种清洁剂以及何时使用

由于脂质膜的不可渗透性,抗体是一种大型蛋白质,在进入细胞内结构时面临障碍。透化是 IF 过程中的关键步骤,它在细胞膜上创建开口,使抗体能够有效地到达细胞内靶标。是否需要单独的透化步骤取决于所选的固定方法。

如前所述,在有机溶剂的情况下,细胞膜在固定过程中变得自然可渗透,从而无需在封闭前进行额外的透化步骤。另一方面,用化学交联剂固定的样品需要用去污剂进行补充处理,以实现有效的透化。通常使用 Triton X-100 或 NP-40 等常见洗涤剂,但皂苷、Tween 20 或洋地黄皂苷等替代品也可能适用。

去污剂的选择会影响结果,影响从细胞膜上去除特定分子并为抗体进入创造不同的孔径。因此,建议使用不同浓度和孵育时间进行实验。典型的起始点是在室温下用 PBS 中的 0.1% Triton X-100 进行透化 15-20 分钟。

洗涤剂不仅限于透化步骤;它们经常被掺入封闭、洗涤和染色缓冲液中。这种多方面的用途归因于去垢剂能够提高封闭效率并在后续洗涤步骤中最大限度地减少非特异性抗体结合。

然而,如果您的目标位于膜的细胞外侧,则绕过透化步骤可能会产生更清晰的结果。这种方法可防止与仍位于细胞内的任何目标蛋白结合,从而增强 IF 染色的特异性。

3. 使用正确的封闭解决方案

为了减轻非特异性抗体结合并从而最大限度地减少背景信号,建议在开始抗体孵育之前使用封闭溶液。至关重要的是,用于封闭的蛋白质不应与一抗来自同一物种,因为这可能会损害二抗对一抗的特异性。最有效的封闭溶液通常涉及来自产生二抗的物种的血清。例如,当使用驴产生的针对鼠一抗的二抗时,理想的封闭试剂是 正常驴血清.

在各种情况下,1-5% 的稀释液 牛血清白蛋白 (BSA) 被证明是一种多功能蛋白质阻断剂,适合与任何二抗一起使用。在整个染色方案中保留封闭剂并将其纳入所有解决方案(包括抗体稀释液)中,可确保全面且一致地减少非特异性结合,从而有助于 IF 程序的整体成功。

4. 明智地选择您的抗体和荧光团

实现高质量 IF 染色的关键在于仔细选择一抗,这一决定会对实验的成功产生重大影响。各种类型的一抗(例如多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体)具有不同的特性。

多克隆抗体:

多克隆抗体包含异质混合物,可识别特定抗原的不同表位。虽然多克隆抗体产生强大的信号,但其批次间差异较大、存在交叉反应性且缺乏特异性。

单克隆抗体:

单克隆抗体可识别每个抗原的单个表位,具有高特异性、低非特异性交叉反应性和最小的批次间差异。

重组抗体:

重组抗体利用已知和定义的抗体编码序列,以最小的批次间差异提供长期、安全的供应。这一特性允许工程和操作来适应特定的应用。

除了抗体选择之外,了解两种主要染色技术(直接染色和间接染色)也至关重要:

直接染色:

在该技术中,荧光团直接与一抗偶联,从而缩短了总体免疫染色时间。然而,一抗的成本可能会更高,因为每个一抗都预先与荧光团结合。

间接染色:

该方法涉及两个步骤,包括用未标记的一抗进行染色,然后使用荧光团偶联的二抗来识别一抗的宿主物种。这种方法可以在复用 IF 实验中实现信号放大、灵活性和经济高效的替代方案。

在进行多重 IF 染色时,请仔细考虑不同一抗的物种来源,以及结合荧光团的不同波长光谱 二抗, 是必不可少的。此外,除了光谱特性之外,荧光团的光稳定性也起着至关重要的作用。过度暴露在光线下引起的光漂白会影响荧光。选择光稳定性荧光团对于确保显微镜结果可靠至关重要。

探索开创性 CF染料,以其无与伦比的亮度、卓越的光稳定性和出色的溶解度而闻名——这是实现最佳 IF 染色结果的基本解决方案。

表 2:多重实验设置示例

目标一抗二抗颜色常见荧光团亚细胞定位
的DNADAPIBlueDAPI
肌动蛋白鬼笔环肽绿色CF 488细胞骨架
目标1小鼠抗A山羊抗鼠橙红色CF 568任何
目标2兔抗B山羊抗兔远红CF 647任何

5. 探索可变抗体孵育时间和稀释度

完成涉及固定、透化和封闭的样品制备后,关键的免疫反应阶段开始。在此阶段,引入特定的一抗来标记样本内所需的目标结构。为了优化此过程,建议通过抗体滴定确定最低有效浓度,范围为 1:50 至 1:1,000。这种方法有助于确定所需的最小抗体量,同时最大化信号背景比。抗体的亲和力在决定孵育时间方面发挥着重要作用,在室温下通常为 1-2 小时。对于那些寻求增强结果的人来说,4°C 过夜孵育是一个可行的选择。

一般来说,与较短的孵育时间和较高的抗体剂量相比,较长的孵育时间(例如,4°C,过夜)和较低的抗体浓度会产生更清晰、更强和更特异的染色模式。

6. 洗涤的重要性

尽管洗涤步骤看似常规,但它是染色方案中最关键的步骤之一。获得具有最小背景信号的高质量图像取决于每一步的彻底和仔细的清洗。这在 STORM 成像中变得尤为重要,其中每个荧光团的检测都至关重要。

通常,使用 PBS 进行洗涤,同时添加去污剂以尽量减少非特异性抗体结合。如果时间允许,每个洗涤步骤允许几分钟有助于洗涤缓冲液在整个样本中有效扩散。确保对清洗阶段的精心关注对于整个染色过程的成功至关重要,这对于生成高质量和可靠的图像做出了重大贡献。

7. 不要忽视控制的重要性

对照的缺失或滥用可能导致数据不准确和假阳性结果。当优化方案、探索不同条件或使用新抗体时,这一点变得尤为重要。包含精心设计的对照不仅可以确保实验设置的可靠性,还可以建立对所获取数据的信任。

考虑以下基本控制措施:

阳性对照:

始终在 IF 实验中加入阳性对照。这种控制对于确定染色过程中是否发生任何问题至关重要。阳性对照可以由已知目的蛋白大量表达的细胞组成,无论是内源性的还是通过过度表达的。

自发荧光控制:

分析细胞自发荧光,特别是容易产生自发荧光的样本,例如脑细胞。包含仅二抗的对照有助于区分观察到的荧光是否源自背景自发荧光。

抗体非特异性结合对照:

仅使用二抗(不含一抗)对样品进行染色,以揭示观察到的信号是否是组织或细胞样品内二抗非特异性结合的结果。

同种型对照:

将样品与与一抗具有相同同种型和浓度的非免疫抗体一起孵育。该对照确保任何观察到的染色不是由一抗的非特异性相互作用引起的。

通过努力整合这些控制,您不仅可以增强 IF 数据的有效性,还可以为实验结果的准确性建立信任基础。


案例

Im K、Mareninov S、Diaz MFP、Yong WH。免疫荧光染色简介。分子生物学方法。 2019;1897:299-311。 doi:10.1007/978-1-4939-8935-5_26。电话号码:30539454; PMCID:PMC6918834。

Jamur MC,Oliver C。细胞膜的透化。 方法分子生物学. 2010;588:63-66. doi:10.1007/978-1-59745-324-0_9

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