CRISPR-Cas9 基因编辑 CRISPR技术彻底改变了生物医学研究，为DNA修饰提供了前所未有的精准度。然而，如何高效安全地将CRISPR组件递送至靶细胞仍然是一个重大挑战。 腺相关病毒（AAV） 由于其安全性、组织特异性和长期基因表达，已成为领先的运载工具。

什么是 CRISPR-Cas9？它是如何工作的？

CRISPR-Cas9 是一种突破性的基因编辑工具，最初源自细菌的天然免疫防御系统。它因其 精确, 效率汽车保险理赔及 多功能性.

CRISPR-Cas9 是一个双组分系统：

• Cas9核酸酶： 这是分子“剪刀”，可以在基因组的特定位置切割双链DNA。一旦DNA被切割，细胞的天然修复机制就会被激活。这些修复途径主要 非同源末端连接 (NHEJ) or 同源定向修复 (HDR)，可以用来破坏基因或引入精确的基因改变。
• 向导RNA（gRNA）： 这是一种短的合成RNA分子，能够引导Cas9到达精确的目标序列。它通过与DNA形成互补的碱基对来实现这一点，从而确保在正确的位置进行切割。除了匹配目标DNA外，成功的结合和切割还需要附近存在一个 PAM（原型间隔区相邻基序） 序列 — 例如， 5′-NGG-3′ HPMC胶囊 SpCas9。PAM 对于 Cas9 识别和切割 DNA 至关重要。

DNA 被切割后会发生什么？

Cas9 切割 DNA 后，细胞会将断裂检测为损伤，并迅速启动其天然修复系统。修复途径的选择决定了 DNA 是被简单地修补错误，还是被精确地改写，这对于基因组编辑的结果至关重要。

1.非同源末端连接（NHEJ）

• 这是细胞的快速修复方法。
• 它直接将断裂的 DNA 末端连接在一起，但 容易出错，往往导致小 插入或删除（indel）.
• 用例： 这些随机变化可能会破坏基因功能——非常适合 基因敲除实验.

2. 同源性定向修复（HDR）

• 这是一种更精确但效率较低的途径。
• 该单元使用 修复模板 （可由研究人员提供） 插入或更正 断裂位点的特定DNA序列。
• 用例： 完美的 基因校正 or 敲入 策略，例如引入治疗基因变体。

为什么 AAV 是 CRISPR 基因传递的主要载体

高效地将 CRISPR 组件递送至细胞对于基因组编辑的成功至关重要。在众多递送方法中，AAV 已成为一种热门选择。

AAV 非常适合 CRISPR 递送，因为它们：

• 感染分裂细胞和非分裂细胞：
  AAV 可以有效进入多种细胞类型，包括非分裂细胞，例如神经元、肌纤维和肝细胞。这 广向性 对于瞄准那些难以编辑的组织来说至关重要。

• 与腺病毒或慢病毒相比，免疫原性较低：
  AAV 通常对免疫系统具有良好的耐受性，从而导致 降低严重免疫反应的风险这使得它们更安全 体内 应用，特别是长期或重复治疗。

• 提供长期表达：
  一旦递送，AAV 基因组主要以附加体（非整合 DNA）的形式存在于细胞核中，从而允许 稳定、持续的表达 对 CRISPR 组件进行数月甚至数年的修复——这对于需要持续基因改造的疾病来说非常重要。

• 提供一系列具有不同组织靶向性（趋向性）的血清型：
  不同的 AAV 血清型天生偏好不同的组织（例如，AAV9 针对心脏和肌肉，AAV8 针对肝脏，AAV2 针对视网膜）。研究人员可以选择或改造特定的血清型，以提高递送效率并最大限度地减少脱靶效应。

将 CRISPR 包装到 AAV 中

虽然 AAV 是 CRISPR 递送的高效载体，但它们的载货能力相对较小，约为 4.7 千碱基（kb）。 这使得将 Cas9 蛋白和 sgRNA 装入单个 AAV 变得颇具挑战性。例如， SpCas9 （从 化脓性链球菌)，这是第一个被广泛使用的Cas9酶，相对较大（约4.2 kb），几乎没有空间容纳必需的调控元件和引导RNA。一种更小、与AAV更兼容的Cas9酶， 萨卡斯9 （从 金黄色葡萄球菌)，后来被认为是一种有前途的替代方案，由于其尺寸较小（~3.2 kb），具有更容易包装到 AAV 载体中的优势。

为了克服 AAV 的尺寸限制，已经开发出几种创新策略和方法：

突破尺寸限制的交付策略和创新

• 单个 AAV 系统：
  这种方法需要将 Cas9 蛋白（例如 SaCas9）和 gRNA 包装到一个 AAV 载体中。这是一种简单高效的方法，非常适合小规模的基因组编辑。然而，它受限于 AAV 载体的大小，因此仅适用于较小的 Cas9 变体，例如 SaCas9。该系统非常适合简单的基因敲除实验或靶向突变实验，在这些实验中，较小的编辑就足够了。
• Mini-Cas蛋白：
  最有前景的创新之一是使用微型 Cas 蛋白，例如 Cas12f（约 1.5 kb）。与传统的 Cas9 酶相比，这些较小的 Cas 蛋白尺寸显著减小，因此可以轻松包装到单个 AAV 载体中，无需拆分。微型 Cas 蛋白保留了基因组编辑功能，同时克服了 AAV 包装的尺寸限制，使其成为更广泛的应用的理想选择，包括那些需要小而精确的基因组修饰的应用。
• 分裂Cas9：
  该策略涉及将Cas9蛋白（例如SpCas9）拆分成两部分，每部分包装到单独的AAV载体中。这些载体同时递送至靶细胞，Cas9组件在那里重新组装并进行基因组编辑。该系统允许使用更大的Cas9蛋白，例如SpCas9，用于更复杂的编辑。然而，这种拆分的AAV系统存在一些缺点，包括效率较低（因为两个载体必须同时感染同一细胞）以及协调递送的复杂性增加。
• 双AAV：
  解决包装难题的另一个方案是使用双AAV系统，将Cas9蛋白及其对应的gRNA分别包装到不同的AAV载体中。与分离系统类似，这些载体被共同递送至靶细胞，并在细胞内组装并执行所需的基因编辑。这种方法通过将载体组分分配到多个载体中，有效地克服了AAV的“货物”大小限制。它还允许使用更大的Cas9蛋白，同时保持递送必要调控元件的能力。与分离系统类似，该方法需要仔细协调，以确保两个AAV载体都能有效感染同一细胞。

• 规模较小的推广者
  使用较小的启动子来驱动Cas9和sgRNA的表达，可以释放AAV有效载荷中的空间，从而容纳其他必要的元件。例如，可以使用工程化的启动子来实现高表达水平，同时保持较小的尺寸。 

AAV-CRISPR 递送的关键工具和技术

AAV 因其能够高效转导多种细胞类型并保持低免疫原性而成为 CRISPR 递送的广泛选择。然而，优化 AAV 递送需要一些关键工具和策略，以确保基因组编辑的精准性和有效性。这些策略侧重于增强组织特异性表达、gRNA 设计、修复模板递送以及对 Cas9 活性的时间控制。

1. 组织特异性表达的启动子： 启动子对于控制 CRISPR 组件（例如 Cas9 和 gRNA）在靶生物体内的表达位置和时间至关重要。不同的启动子可实现组织特异性表达，最大限度地减少脱靶效应并提高基因编辑的精度。常见的启动子类型包括：
   • 无处不在的推动者： 诸如 CAG 和 EF1α 之类的示例能够在多种细胞类型中广泛表达，从而使其适用于一般的基因编辑应用。
   • 肝脏特异性启动子： TBG 和 ApoE 专门针对肝脏，这对于基于肝脏的基因治疗和减少其他组织中不必要的表达至关重要。
   • 神经元启动子： 突触蛋白和 CaMKIIα 启动子专门驱动神经组织中的表达，从而实现大脑和神经系统中的靶向基因编辑。
   • 肌肉特异性启动子： MHCK7 和 Desmin 等启动子旨在针对肌肉细胞，这对于与肌肉疾病相关的应用非常重要。
2. gRNA设计和表达： gRNA 负责引导 Cas9 蛋白到达正确的基因组位置，因此其设计对于 CRISPR 介导的基因组编辑的精准度至关重要。gRNA 表达的关键方面包括：
   • Pol III 启动子（U6 或 H1）： 这些启动子用于驱动gRNA的表达，确保其在RNA聚合酶III的作用下转录为小RNA。U6和H1启动子常用于CRISPR实验，以维持较高的gRNA表达水平，从而实现高效的基因组编辑。
   • 多重 gRNA： 当需要同时编辑多个基因时，可以使用多重 gRNA。如果 AAV 载体空间允许，可以将多个 gRNA 包装到单个 AAV 中，从而实现一次递送编辑多个靶标。这对于复杂的基因编辑任务（例如全基因组筛选或多基因治疗应用）尤其有用。
3. 同源性定向修复（HDR）的修复模板： HDR 是进行精准基因编辑（例如点突变或更大片段插入）的首选途径。为了实现 HDR，供体 DNA 模板与 CRISPR 组件共同递送，从而将所需的基因改变整合到基因组中。关键点包括：
   • 捐赠者模板的共同递送： 供体模板旨在匹配基因改变，可以包装在同一AAV中，也可以包装在单独的载体中。该模板有助于通过HDR通路整合所需的编辑。
   • 双AAV HDR策略： 对于更大规模的基因编辑，通常需要双AAV系统。这些策略经过优化，可以提高HDR效率，尤其是在处理更大的基因构建体或复杂的修复模板（这些模板超出了单个AAV的容量）时。
4. 可调控系统： 控制CRISPR组件在递送后的表达，可以最大限度地减少脱靶效应并减少不必要的免疫反应，从而显著提高安全性和有效性。一些关键的可调控系统包括：
   • 药物诱导的Cas9系统： 这些系统允许通过施用特定药物（例如四环素或强力霉素）来控制Cas9的表达。这实现了时间调控，确保Cas9仅在需要时才活跃，这对于需要精确控制基因编辑活性的应用至关重要。
   • 自灭活系统： 这些系统旨在限制Cas9表达的持续时间，从而降低脱靶效应的风险。Cas9的活性是短暂的，一旦编辑过程完成，该系统就会“自我失活”，确保基因编辑过程不会持续超过预期的时间范围，从而增强该方法的整体安全性。

总之，这些工具和策略为 AAV-CRISPR 传递提供了关键的增强，确保基因编辑过程对于各种治疗应用既有效又安全。

使用 AAV-CRISPR 进行体内基因编辑：方法和实际案例

体内 基因组编辑涉及将 CRISPR 组件直接递送到生物体中，从而实现系统性或组织特异性的修改，而无需 体外 细胞操作。AAV 尤其 非常适合这种方法 因为它们能够有效地针对特定组织。

• 直接治疗应用： 体内 编辑消除了细胞提取和再输注的需要，简化了流程并降低了相关风险。
• 广泛的组织靶向： AAV 能够将 CRISPR 组件同时递送至多个器官（例如肝脏、肌肉、中枢神经系统），从而提供广泛的治疗可能性。
• 永久或持久的影响： AAV 提供持续表达，确保单次治疗即可获得长期治疗效果。
• 非侵入性且经济高效： 体内 编辑减少了对复杂、昂贵的程序的需求，例如 体外 细胞操作，简化治疗过程并降低总体成本。
• 降低免疫反应的风险： 体内 基因编辑降低了免疫排斥的可能性，因为编辑过的细胞仍留在体内，避免了与重新引入外部修改的细胞有关的并发症。

示例 体内 AAV-CRISPR编辑

1. 肝脏靶向编辑

• 家族性高胆固醇血症 (FH)
  • 方法：AAV8 携带 CRISPR-Cas9 来破坏 PCSK9 （LDL 胆固醇的调节剂）。
  • 结果：小鼠和非人类灵长类动物（NHP）的 PCSK50 水平降低约 9%，从而导致 LDL 胆固醇降低。
  • 临床相关性：FH 患者的潜在一次性治疗。

2. 神经和眼部疾病

• 亨廷顿舞蹈症（HD）
  • 方法：AAV-CRISPR-Cas9 破坏突变体 tt 在纹状体神经元中。
  • 结果：减少突变 HTT 聚集体并改善小鼠模型中的运动功能。
• 莱伯先天性黑蒙症 10（LCA10）
  • 方法：AAV5 携带 CRISPR-Cas9 去除致病 CEP290 内含子突变。
  • 结果：动物模型视力部分恢复。
  • 临床试验：EDIT-101（Editas Medicine）——首次针对 LCA10 的人体 AAV-CRISPR 试验。

3. 肌肉定向编辑

• 杜氏肌营养不良症 (DMD)
  • 方法：AAV9-CRISPR 切除外显子 51 DMD 基因恢复肌营养不良蛋白阅读框架。
  • 结果：小鼠、狗和 NHP 中的功能性肌营养不良蛋白恢复。

4。 心血管疾病

• 肥厚性心肌病（HCM）

• 方法：AAV9-CRISPR 破坏突变体 MYBPC3 在心肌细胞中。
• 结果：小鼠的心脏功能得到改善。

CRISPR-AAV 疗法的当前挑战和未来方向

尽管 体内 AAV-CRISPR基因编辑仍面临诸多技术和转化挑战。克服这些障碍对于充分释放基因组编辑在多种疾病治疗中的潜力至关重要。 矢量设计、编辑技术和制造工艺正在塑造该领域的未来方向，旨在提高临床应用的安全性、有效性和可及性。

1.免疫反应

• 挑战： 由于先前接触过病毒，许多人体内已存在针对天然AAV血清型的中和抗体（NAb）。这些抗体会阻碍AAV的有效转导，从而限制CRISPR基因编辑疗法的有效性。
• 解决方案：
  • 衣壳工程： 开发能够逃避现有免疫同时保持或改善组织特异性的新型 AAV 衣壳。
  • 免疫抑制策略： 正在探索在 AAV 给药期间临时使用免疫调节剂。
  • 血清型转换： 如果有必要，可以施用不同的 AAV 血清型来重复给药。

2. 脱靶效应

• 挑战： CRISPR-Cas9 有时会在与目标序列相似的位点造成意外的双链断裂，从而有导致基因组不稳定、致癌或其他不良影响的风险。
• 解决方案：
  • 高保真Cas9变体： eSpCas9、HypaCas9 和 HiFi Cas9 等工程版本可减少脱靶编辑，同时保持较高的靶向活性。
  • 碱基编辑和主要编辑： 这些下一代编辑器可以进行精确的核苷酸改变而不会引起双链断裂，大大降低了脱靶突变的风险。
  • 改进的 gRNA 设计算法： 计算工具有助于优化 gRNA 序列的特异性。

3. 持久性与短暂性

• 挑战： 永久性基因组修饰虽然效果显著，但如果出现意外后果，则可能存在风险。在某些治疗方案中，短暂、可控的编辑活动可能更为理想。
• 解决方案：
  • 诱导系统： 药物可调节的 Cas9 系统（例如，强力霉素诱导的）允许定时控制 Cas9 活性。
  • 自失活系统： 包含自切割元素或自限制 Cas9 表达的设计可减少对编辑机制的长期暴露，从而增强安全性。
  • 临时交付替代方案： 使用 mRNA 或蛋白质形式的 Cas9 而不是 DNA 载体来实现短暂但有效的编辑。

4.制造和可扩展性

• 挑战： 临床级AAV载体的大规模生产仍然成本高昂、耗时长且技术要求高。保持高滴度和纯度（低空衣壳率）对于治疗成功至关重要。
• 解决方案：
  • 改进的生产平台： 三重转染系统、稳定生产细胞系和杆状病毒系统正在进行优化，以实现更高的产量和可扩展性。
  • 连续净化技术： 亲和层析技术（例如 AVB Sepharose 柱）等进步有助于更有效地纯化 rAAV。
  • 自动化和封闭系统制造： 降低污染风险并提高大批次的一致性。

AAV 介导的 CRISPR 递送是一种有效的策略 体内 基因组编辑技术，提供精准性、组织特异性和长期效应。尽管包装限制和免疫反应等挑战依然存在，但微型编辑器、分离系统和可调控Cas9的创新正在推动该领域的发展。

临床试验（例如针对 LCA101 的 EDIT-10）证明了 AAV-CRISPR 疗法在现实世界中的潜力。随着研究的进展，我们有望在直接治疗患者遗传疾病方面取得更多突破。

PackGene 的 AAV 和现成的 CRISPR/Cas9 rAAV 解决方案

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PackGene AAV 功能：

• 高产量制造： PackGene 使用专有技术平台（例如优化的细胞系和增强的 RC 和辅助质粒）来实现高纯度和低空衣壳率的优异载体产量（高达 1E+16 GC）。
• 广泛的血清型选择： 包括天然血清型（如 AAV2、AAV8、AAV9）和针对组织特异性靶向的工程变体。
• 监管级生产： 符合 GMP 标准的制造支持从临床前到临床的应用。

现成的 CRISPR/Cas9 rAAV 产品：

• Cas9 在 EFS, 微型CMV, 巨细胞病毒或各种 组织特异性启动子.
• 有多种血清型可供选择，包括 AAV2, AAV8, AAV9汽车保险理赔及 AAV-PHP.eB.
• 有存货 和 一个工作日内即可发货，非常适合快节奏或时间敏感的项目。
• 还提供 高保真Cas9 尽量减少脱靶效应，以及 CPf1 替代基因组编辑的版本。

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