每个研究人员都应该知道的细胞培养中的 7 个关键数字

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每个研究人员都应该知道的细胞培养中的 7 个关键数字

亚特兰蒂斯生物科学
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2025 年 5 月 13 日
阅读时间： 15 分钟

这不仅仅关乎技术：你使用的材料，比如你的基础培养基（比如记忆体, 零售价格指数或的MEM) 和补充剂，例如胎牛血清（FBS），在影响细胞行为方面发挥着至关重要的作用。培养基成分、血清批次质量或培养条件的变化会显著影响生长率、活力、形态和实验可重复性。即使使用值得信赖的品牌，监测和优化培养环境仍然至关重要。

无论您研究的是原代细胞、间充质干细胞还是永生化细胞系，了解和跟踪特定的培养指标都可以确保细胞健康、提高可重复性并增强实验结果。

在本文中，我们重点介绍 七个关键数字 每个研究人员都应该监测并解释为什么它们对于获得一致、高质量的结果很重要。

信息图展示了每位研究人员都应追踪的7个关键细胞培养指标，包括传代次数、细胞接种密度、汇合率、活力率、支原体检测频率、培养基pH值范围以及内毒素水平。浅色背景上，每个参数都以蓝绿色图标标注，重点突出了细胞培养质量控制的基本标准。

1. 传代次数/细胞数量倍增

这个 传代数 反映出一个细胞群被传代的（分裂并重新接种到新的培养皿中）自最初分离或从冷冻保存中复苏以来。每次传代都标志着一轮细胞扩增和增殖。

虽然传代次数通常被视为常规指标，但它在确定 细胞质量、性能和实验可重复性随着时间的推移，细胞在生长过程中积累分子和表观遗传变化 细胞/组织 培养。这些变化可能导致行为发生重大转变，例如基因表达改变、增殖减慢、活力降低或不必要的分化——即使细胞形态保持不变。

为什么我们需要监测和记录细胞传代次数？

监测并记录通道数量可确保：

跨实验的一致性：使用不同传代次数的细胞可能会给您的数据带来差异。
可预测的行为：细胞在特定的传代窗口内表现更一致。超过该窗口，它们可能会出现衰老或遗传漂变的迹象。
合规性和可追溯性：在 GMP 工作流程或出版质量研究中，需要对细胞处理进行完全的可追溯性 - 其中包括传代历史。
做决定：了解传代次数有助于研究人员决定何时创建新的工作库存、丢弃老化的培养物或排除表型变化的故障。

未能追踪通道数量可能导致 无法重复的结果, 误导性结论及 浪费资源 — 尤其是在长期研究或临床前开发过程中。

什么构成了一段话？

在常规细胞培养中，每次传代培养或重新接种都算作一次传代。

然而，一个常见的问题出现了：
解冻冷冻细胞算不算新的传代？
答案是：没有 — 通道数应随 重新播种，不冷冻.

计费示例：
如果你有一个工作细胞系 第1段（P1），然后用胰蛋白酶消化并冷冻这些细胞，然后把小瓶标记为 P2解冻后，它们仍然 P2 直到你再次对它们进行亚培养，此时它们就变成了 P3.

这张分步示意图展示了在冷冻和传代过程中确定细胞传代数的方法。该过程始于一个标有“P=1”（第1代）的培养皿，标记为工作原液。细胞经胰蛋白酶消化后，冷冻保存在标有“P=2”的冻存管中。解冻后，这些冻存管用于接种一个仍标有“P=2”的新培养皿。传代后，细胞将进入第3代（P=3），保存在一个新培养皿和几个冻存管中。其中一个培养皿被指定为用于传代和实验的工作原液，而多个标有P=3的冻存管则被标记为用于冷冻的原液。箭头指示了从P=1到P=3的工作流程方向。 — **图1：** 确定从冻存库存到后续传代培养的传代次数

为什么单靠传代次数是不够的

传代数 不考虑分流比或接种密度因此对细胞实际分裂次数的了解有限。

考虑这种情况：

研究员 A 使用 10:1 的比例分割 P4 的培养物。
研究员 B 在 P10 时以 1:10 的比例分割相同的培养物。
两人都将下一个烧瓶标记为 P11。

然而，1:10 分裂的细胞必须增殖更多才能达到汇合，这意味着它们会经历 人口倍增（PD）更多。 随着时间的推移，即使传代次数相同，也会导致细胞在基因和功能上有所不同。

为什么 PD 追踪很重要

更准确的： 反映真实的复制历史，尤其是当分割率发生变化时。
告知衰老阈值： 对于原代细胞和 MSCs 尤其重要，因为过度复制会导致其功能下降。
增强可比性： 在比较不同捐赠者、培养基配方或实验室的结果时很有用。
支持转化研究： 对于临床级工作流程中的监管文件和可重复性至关重要。

监测 PD 与传代次数和倍增时间可以 多维文化健康观，从而能够做出更好的决策，特别是在长期或转化研究中。

2. 细胞接种密度

细胞接种密度 — 每单位面积（对于贴壁细胞）或每单位体积（对于悬浮细胞）接种的细胞数 — 是 基本参数 在细胞培养中。它直接影响生长速度、形态、基因表达以及下游检测的结果。

播种不正确可能导致：

过度汇合， 导致接触抑制、信号改变或早期衰老
低密度， 这可能会给细胞带来压力、延缓生长或改变行为
实验变异性， 特别是在依赖细胞间相互作用、分泌因子或分化线索的检测中

保持适当的播种密度可确保：

均匀的细胞分布和附着（对于粘附细胞）
最佳营养和氧气获取
跨重复和时间点的一致性
维持关键细胞功能和表型

典型范围

电池类型	推荐播种密度
贴壁细胞	5,000–50,000 个细胞/cm²
悬浮细胞	2×10⁴ 至5×10⁵ 细胞/毫升

这些只是一般范围。最佳密度会根据细胞类型、检测类型、培养容器大小和实验目标而有所不同。

专业提示： 建议在解冻后立即接种比常规传代期间更多的细胞，因为解冻后的细胞活力通常较低。

影响细胞接种密度的因素

细胞密度要求差异很大，取决于：

细胞类型 – 一些细胞（例如原代神经元或内皮细胞）需要紧密的细胞与细胞接触才能生存，而其他细胞（例如成纤维细胞）则能够耐受低密度接种。
申请 - 增殖试验需要较低的起始密度，而分化可能需要更高的初始汇合度。

查阅已发表的文献并进行初步实验，以确定最适合您特定系统的接种密度。适用于某个实验室或细胞系的方法可能不适用于其他实验室或细胞系。

如何计算播种密度

以下是帮助您计算实验正确接种密度的快速指南：

确定所需的播种密度 — 例如，X 细胞/cm²
计数你的细胞 使用血细胞计数器或自动计数器
计算细胞总数 通过将 X 乘以容器的总表面积
离心分离机 细胞悬浮液，并将沉淀物重新悬浮在较小的已知体积（例如 1 mL）中——将此体积称为 Y
计算体积 达到所需播种密度需要使用：

公式：X 乘以表面积，除以 Y 中的细胞浓度，等于重悬细胞的体积 Z 毫升。用于计算接种所需的细胞悬液体积。

计费示例： 2孔板需要每孔10 × 6⁵细胞。如果每毫升细胞密度为1 × 10⁶，则每孔需要0.2毫升细胞。

例如：每孔 2 × 10⁵ 细胞除以每毫升 1 × 10⁶ 细胞，等于每孔 0.2 毫升。此示例展示了如何计算已知浓度细胞所需的接种体积。

3. 汇合率

细胞汇合 指贴壁细胞覆盖培养表面的百分比。它是细胞增殖和整体培养健康状况的快速且重要的视觉指标。

汇合度不仅仅是一个常规指标，它还用于指导整个细胞培养工作流程的决策——从传代和冻存到实验处理和分化。重要的是， 细胞行为, 基因表达及 对外界刺激的反应 都受到汇合水平的高度影响。

什么是细胞汇合？

汇合度不是直接计数细胞，而是 表面覆盖度的视觉评估. 例如，70％汇合的培养瓶有70％的表面积被贴壁细胞占据。

如果使用得当，汇合度有助于确定：

何时分裂或传代细胞
转染或药物治疗的最佳时间
培养物是否适合分化、重编程或收获等下游应用

**图2：** 该示意图显示了显微镜下 4 个视野中的细胞，其汇合度分别为 20%、50%、80% 和 100%。
文献参考：细胞培养基础知识和方案

过度融合的风险

未能在正确的时间传球可能导致：

营养耗竭 和 代谢压力
细胞进入 生长停滞、衰老或凋亡
积累 有毒细胞碎片 来自垂死细胞
形态和基因表达改变 歪曲事实体内条件
更高 污染的风险，特别是真菌或细菌

为什么准确的估算至关重要

尽管汇合度很重要，但通常仍需在显微镜下目测。这种“猜测”具有主观性，不同用户——甚至同一个人在不同日期——的汇合度也可能存在差异。汇合度估算在 60% 到 90% 之间（这是许多操作中最关键的范围），尤其容易出错。

准确且一致地估计汇合支持：

再生性：确保细胞在整个实验中处于相同的生理状态
高效与舒适性：避免因操作不当而导致试剂浪费和工作流程失败
实验有效性：确保转染和药物治疗在最佳生长条件下进行

根据应用推荐的汇合度目标

实践应用	目标汇合度	合理
增殖试验	60-80％	确保积极增长
转染/转导	70-90％	平衡生存力和最佳吸收
区别	因细胞类型而异	有些需要高密度；有些则需要空间进行形态发生的变化
冷冻保存	70-90％	让细胞处于最佳健康状态，以便解冻后恢复
解冻后膨胀	50-70％	防止过度拥挤并支持健康再生

更好地评估汇合度的专业技巧

使用参考图像进行训练和标准化
保存典型汇合阶段的照片记录
尽可能使用 ImageJ 或汇合度分析软件等量化工具
采用自动成像系统进行客观监测

防止过度汇合的策略

过度汇合是一个可预防的问题，但它可能会破坏整个实验。请采取以下主动策略：

定期监测： 每天用显微镜检查培养物并记录观察结果。意外的生长突增可能很快就会发生。
优化播种密度： 起始细胞数量过多会导致细胞快速过度生长。请根据细胞类型、培养皿大小和应用情况调整接种密度。
使用更大的培养容器： 如果频繁传代变得繁重，则扩大到更大的培养瓶或培养板可能会减少处理频率。
调整介质更换频率： 快速生长的细胞可能会快速消耗营养。更频繁地更换培养基有助于维持细胞活力并延缓细胞汇合。
优化培养条件： 确保适当的二氧化碳水平、湿度和温度。处于压力下的细胞可能会表现异常，从而影响生长动态。
建立 SOP 和阈值： 在您的协议中定义明确的汇合阈值 - 例如“当 80％汇合时传代细胞” - 以提高整个实验室的一致性。

4. 生存率

细胞活力 是细胞整体健康状况的关键指标，对于确保实验结果可靠且可重复至关重要。无论您是进行转染、药物检测、分化研究，还是制备用于冻存的细胞，维持较高的细胞活力百分比都有助于确保获得一致且生理相关的结果。

生存能力低下会导致：

由于死亡或濒死细胞的干扰，导致检测结果失真
触发改变基因和蛋白质表达的应激反应
转染或感染效率较低
造成批次间不一致，从而破坏可重复性

目标阈值

健康的细胞培养物具有以下特点 80-95％，并且通常推荐用于大多数标准实验。
FDA 指南： 对于体外基因修饰细胞（例如 CAR-T、MSCs），FDA 建议最低存活率 70%。如果较低，则必须提供支持数据表明它不会影响 安全性, 功效或交货因为死细胞或碎片可能会影响治疗效果。

如何评估可行性

台盼蓝排斥法： 使用血细胞计数器或自动计数器的简单手动计数方法。
使用活性染料进行流式细胞术 （例如，PI、7-AAD）：允许多参数分析。
荧光或比色测定 （例如 MTT、Resazurin）：适用于高通量筛选。

FBS在细胞活力中的作用

FBS 是许多培养基配方中最关键的成分之一。它提供 必需生长因子、激素、粘附分子以及支持 细胞附着、增殖和存活.

运用 值得信赖的高品质FBS 对于维持生存至关重要，因为：

质量差或不稳定的FBS可能导致 不可预测的细胞行为 和 生存能力低。
受污染或热灭活不当的FBS可能导致 细胞毒作用.
批次间差异 FBS 中的残留物会导致实验结果不一致，除非 FBS 经过严格测试和验证.

专业建议： – 始终从信誉良好的供应商处采购胎牛血清，这些供应商应提供：

认证 无病毒和支原体 产品
经过验证 批次一致性 带有预测试选项
产地可追溯 和 道德收藏 做法

导致存活率低的常见原因

解冻或冻融循环不理想
过度汇合培养导致营养耗尽
严酷的酶促分离
污染（例如， 支原体、内毒素)
培养基质量差或补充材料不适当，例如 胎牛血清 (FBS) 不稳定或不一致

提高细胞活力的技巧

使用 VHDL 语言编写 预热的完整培养基 - 高品质胎牛血清
避免过度处理或将细胞长时间暴露在室温下
优化酶促分离条件
保持适当的 播种密度 解冻后促进恢复
执行常规质量控制（例如支原体检测、培养基 pH 值、渗透压检查）

高生存力不仅仅意味着生存，还意味着 确保你的细胞健康、活跃并表现正常. 值得信赖的试剂，例如 认证FBS 形成可靠文化体系的骨干。

5. 支原体检测频率

支原体污染 支原体污染是细胞培养中最隐蔽、最难诊断的问题之一。与细菌或真菌污染不同，支原体不会造成培养基浑浊，而且常常不被察觉，但却悄无声息地破坏着实验的完整性。

这些微小的、无细胞壁的细菌可以：

改变细胞代谢、增殖和基因表达
干扰转染效率和细胞因子反应
影响可重复性并导致错误的实验结论
数周或数月内不易被发现，尤其是在共用孵化器或实验室中

建议测试频率

情况	测试频率
常规细胞培养维护	每 4-6 周
在关键实验之前	至少提前一周
冷冻保存细胞库存之前	强制性
解冻储存的细胞后	解冻后 3-5 天内
获得新的细胞系后	抵达后立即
抗生素治疗后或疑似污染后	需要进行后续测试

需要频繁监测的高风险场景

共享或核心实验室 环境中
长期文化 实验
与实验室合作 原代细胞或干细胞S
实验室使用 混合或共培养
制备细胞的设施 临床或临床前用途

测试方法

PCR试剂盒: 快速、灵敏、应用广泛
DNA染色（例如，赫斯特 33258)：适用于基于显微镜的检测
酶促测定： 常规筛查快捷简便
基于培养的检测： 黄金标准，但耗时且不适合快速决策

最佳实践

检疫新的细胞系，直到清除
维护详细记录 所有测试结果
实施 标准作业程序 用于污染响应
避免长期使用抗生素 掩盖污染

主动、定期的支原体检测和频繁 支原体净化实践 只需投入少量的时间，就能节省数月的劳作时间。

6. 培养基pH范围

这个 培养基pH值 在影响方面发挥着至关重要的作用 细胞活力、新陈代谢、酶活性及 总体实验可重复性任何偏离最佳pH值范围的情况都可能导致细胞行为改变、数据不可靠，甚至培养完全失败。维持稳定的pH值对于敏感细胞类型（例如原代细胞和干细胞）尤为重要。

哺乳动物细胞的最佳pH值范围通常在 7.2 - 7.4pH 值低于 7.2 被视为酸性，而 pH 值高于 7.4 被视为碱性。

细胞培养基pH值的变化表明什么？

酸性条件 – 通常表示 过度生长的文化 或可能 微生物污染当细胞代谢营养物质时，它们会释放酸性副产物，例如乳酸，从而降低pH值。这在密集培养或培养基更换频率不高的情况下尤为常见。

碱性条件 – 可能源于 二氧化碳不足₂ 各级在孵化器中或 长时间暴露 培养皿与空气接触。当细胞代谢不活跃时，例如细胞死亡后或解冻后早期，也可能出现这种情况。

pH调节机制

1. 酚红指示剂

酚红是细胞培养基中常见的 pH 指示剂，它会从粉色（中性）变为橙色或黄色（酸性），从而 视觉提示 实时监测培养基状态。培养基变黄表示酸度升高，通常表明需要更换培养基，无论预定的补料时间如何。

**图3：** 细胞培养基通常添加酚红作为pH指示剂。培养基的颜色反映了pH值——粉色表示pH值为中性，黄色发出酸性条件信号，紫色表明存在碱性环境。
文献参考：菌种采集

酚红会影响细胞吗？

在大多数情况下，酚红是无害的，并且有助于维持健康的培养物。然而，某些 敏感细胞系或实验装置 可能需要 无酚红培养基这是因为酚红具有较弱的雌激素样活性，可能会影响激素反应细胞或干扰对雌激素化合物敏感的检测。它还可能在流式细胞术或荧光检测等技术中引起背景信号。对于这些情况，建议使用不含酚红的制剂。

2. 碳酸氢钠-CO₂缓冲系统

碳酸氢钠 (NaHCO₃) 是一种天然、无毒的缓冲液，常用于细胞培养基。它需要 5% 二氧化碳培养箱起到缓冲作用，因为二氧化碳溶解在培养基中，形成碳酸，碳酸与碳酸氢根离子相互作用， 稳定pH值.

培养基中 NaHCO₃ 的含量决定了维持 pH 值所需的 CO₂ 含量。正常组织的生理 pH 通常认为在 7.2 到 7.4 之间，但某些疾病状态（例如癌症）可能需要在较低的 pH 下培养。添加了 Earle 平衡盐溶液 (EBSS) 的 Eagle 最低必需培养基 (EMEM) 和大多数其他细胞培养基通常含有 26 mM 碳酸氢钠，而 DMEM 的浓度更高，为 44 mM。

3. HEPES缓冲液——用于在CO₂培养箱外保持pH值稳定

HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）是一种 两性离子有机缓冲液 广泛用于细胞培养，以维持稳定的pH值，尤其是在二氧化碳水平可能波动的环境中。HEPES在 pH 值范围 6.8 至 8.2，使其适用于多种哺乳动物细胞系。

为什么使用 HEPES？

强大的缓冲能力： HEPES 比碳酸氢钠提供更稳定的 pH 控制，特别是在二氧化碳浓度不稳定的环境中。
CO₂-独立缓冲： 与碳酸氢盐不同，HEPES 不需要 CO₂ 即可发挥作用，这使其成为在标准培养箱外进行的实验的理想选择（例如，活体成像、流式细胞术和分子生物学测定）。
最小pH值漂移： HEPES 有助于防止细胞暴露在周围空气中时 pH 值的快速变化，从而提高培养箱外处理时的一致性。

Biowest 基础培养基——满足各种细胞培养需求的灵活配方

生物西提供种类丰富的基础培养基配方，以满足研究人员在处理各种细胞类型和实验条件时的不同需求。无论是培养稳定的永生化细胞系、敏感的原代细胞还是干细胞，Biowest 都能提供 即用型培养基 含或不含 HEPES 和碳酸氢钠，以支持最佳 pH 控制和缓冲。

标准选项包括：

含碳酸氢钠： 非常适合在 5% CO₂ 培养箱中使用，支持经典的碳酸氢盐缓冲系统。
使用 HEPES 缓冲液： 适用于需要在 CO₂ 培养箱外保持稳定 pH 值的实验，例如实时成像、流式细胞术或现场采样。
不含HEPES/碳酸氢盐： 可根据特定实验需求灵活定制缓冲系统。

7. 内毒素水平

内毒素，也称为 脂多糖（LPS）， 内毒素是革兰氏阴性细菌外膜的组成部分。这些分子在细菌生长过程中会少量释放，而在细菌裂解时则会大量释放。即使是微量的内毒素也会损害培养细胞的健康，尤其是在干细胞扩增、免疫疗法开发、生物生产或炎症性疾病建模等敏感应用中。它们的影响通常很微妙，但可能导致不稳定、不可重复或误导性的实验结果。

内毒素如何影响细胞培养结果

即使浓度较低，内毒素也能：

刺激细胞因子和趋化因子的分泌 （尤其是免疫相关细胞）
激活炎症信号和氧化应激通路
破坏正常细胞增殖、分化和形态
损害蛋白质表达 在重组系统中
降低细胞活力 or 诱导细胞凋亡—特别是在原代细胞或干细胞培养中

特别容易受到内毒素影响的细胞类型包括：

免疫细胞： 巨噬细胞、树突状细胞、PBMC
干细胞： MSCs、ESCs、iPSCs
用于转染、病毒载体生产或治疗性蛋白质制造的细胞

内毒素污染的常见来源

内毒素可以通过多种途径进入您的培养系统：

水用于缓冲液或试剂的制备
商业来源 培养基、血清和补充剂
受污染的实验室器具 （玻璃或塑料）
消毒不当 或重复使用培养容器
暴露于空气或 无菌技术差

避免内毒素诱导的细胞培养问题的步骤

使用无内毒素水或超纯水 – 用于制备缓冲液、清洗玻璃器皿或稀释培养基的水必须是高纯度的（例如，I 型超纯水）并且经过认证不含内毒素。

选择优质、低内毒素的FBS – FBS 是内毒素的常见来源。请选择经供应商认证为低内毒素水平的批次——理想情况下，对于一般应用，内毒素水平应低于 10 EU/mL；对于敏感应用，内毒素水平应低于 1 EU/mL。 比奥韦斯特 FBS 经过 LAL 测试并提供批次特定证书。

确认培养基和添加剂的内毒素检测 – 确保基础培养基、补充剂（例如生长因子、抗生素）和缓冲液在严格的质量控制下生产，并经过内毒素污染测试。

遵循正确的玻璃器皿高压灭菌程序 – 残留内毒素具有热稳定性，因此要确保玻璃器皿不仅要消毒，而且在必要时还要去除热原——通常采用≥250°C 的干热灭菌，持续 30 分钟。

使用经认证的无内毒素塑料器皿 – 选择经制造商认证为无内毒素的一次性塑料器皿（例如，移液器吸头、试管、烧瓶）。避免重复使用或清洗可能接触过环境污染物的实验室器皿。

尽量减少接触环境污染物 – 在无菌环境中快速操作。仅在层流罩下打开培养容器，并减少在培养箱外的操作时间，以最大程度地降低环境内毒素暴露的风险。

Biowest质量保证

比奥韦斯t 提供 FBS 和基础培养基经过 LAL 测试并提供 批次特定分析证书 内毒素水平，确保 一致性和可靠性 跨实验。其严格的质量控制流程即使在最敏感的应用中也能确保可重复的高性能结果。

Biowest 的 超低内毒素胎牛血清 专为满足敏感细胞培养系统的严格要求而设计。每批产品均经过精心配制和全面测试，符合严格的内毒素阈值，是培养原代细胞、干细胞以及用于临床或生物制药应用的细胞的理想选择。Biowest 可确保您的细胞在支持以下两方面的环境中生长： 生存力和完整性.

结语

细胞培养既是一门技术科学，也是一门数值科学。掌握关键的定量参数——例如 传代次数、接种密度和汇合率——可能意味着可重复结果和实验失败之间的差异。同样重要的是一些不太明显但关键的指标，例如 活力、支原体检测频率、培养基 pH 值和内毒素水平这七个数值共同构成了稳健可靠的细胞培养系统的基础。通过保持警惕并了解这些数值，研究人员可以提高一致性，保护细胞健康，并确保获得有意义的结果——无论是使用标准细胞系还是推进敏感的临床应用。