为什么胎牛血清（FBS）对现代细胞疗法存在问题

1. 道德问题

• 动物福利问题： 胎牛血清（FBS）是从怀孕母牛屠宰过程中取出的胎儿体内采集的，这引发了人们对动物遭受痛苦的担忧。该过程通常不使用麻醉剂，而且采血时胎儿仍然活着，这引发了伦理困境。

• 缺乏监管：许多国家缺乏对胎儿血液采集的严格规定，这意味着程序可能有所不同，动物福利标准可能不一致。

• 与肉类行业的联系：由于 FBS 是肉类工业的副产品，其生产与工厂化养殖和不可持续的农业实践息息相关，进一步引发了道德问题。

• 对环境造成的影响：生产 FBS 的肉类行业是造成环境危害的重要因素，包括高用水量、温室气体排放和土地退化。

2. 批次间差异和可扩展性挑战

FBS 是一种复杂的培养基补充剂，批次间存在固有的差异。其成分的细微变化会显著影响细胞培养条件，进而导致细胞特性不一致，甚至改变最终的治疗产品。由于细胞对其培养环境高度敏感，即使是微小的变化也可能影响其功能和性能，因此这一点尤为重要。

造成这种变化的因素包括：

• 源畜群的遗传多样性。
• 动物饮食的变化。
• 血清制造过程本身。
• 血清成分极其复杂，包括约 1800 种蛋白质和 4000 种代谢物。
• 血清规格的广泛可接受范围

随着细胞治疗行业日趋成熟，临床试验进入关键的3期研究阶段，对规模化生产、工艺验证和原材料质量保证的需求将日益增长。这种日益增长的需求可能会推动培养技术、原材料采购和检测方法的变革。

由于细胞对其培养条件高度敏感，培养环境的任何变化都可能改变细胞的生理和性能特征，并可能影响产品的关键质量属性。因此，不受控制的放大生产可能导致最终产品活性的变化，使小规模生产和大规模生产之间难以保持一致性。

此外，确保持续供应所需数量的高质量原材料也面临巨大挑战。难以扩大原材料生产规模以满足需求并保持质量，这对细胞疗法的商业化构成了巨大挑战。

3. 人造部件的安全问题

• 由于材料的混合性质，基于人体血液成分的无血清配方具有额外的安全风险。
• 确保 安全性 涉及彻底的捐赠者筛选程序、病毒感染的安全测试以及制造过程中的病毒灭活
• 血液制品的复杂监管要求:
  不同的监管机构对血液成分有特定的安全和测试要求，这增加了复杂性并可能限制材料的可用性。
  • 血浆捐献者标准（例如， CJD 和 vCJD 传播风险).
  • 病原体检测、测试方法和源材料可追溯性。
  • 血浆采集设施的许可和必要的认证（例如 FDA、EMA）。
  • 病毒检测
  • 病毒灭活 以及制造过程中的去除步骤。

4. 扩大供应和商业化风险的限制

• 全球供应来源： 细胞治疗行业使用的胎牛血清（FBS）约90%来自三个国家：美国、澳大利亚和新西兰。
• 鉴于 FBS 是肉类工业的副产品，因此该行业没有动力专门为获取血清而扩大养牛规模。  
• 对肉类工业副产品的依赖限制了大幅扩大血清产量的能力。
• FBS 需求的任何显著增长都无法通过单纯饲养牛来满足，因此供应本身就受到限制。

鉴于供应有限、道德审查和成本上升等因素，对 FBS 的依赖可能会成为未来细胞药物可扩展性和商业化的主要瓶颈。

该行业越来越积极地寻求无血清或无外来成分的替代品，以确保制造的一致性、法规遵从性和长期可持续性。

胎牛血清 (FBS) 的制备方法：分步概述

1. FBS 的生产始于屠宰场，在那里，胎儿从被屠宰以供食用的怀孕母牛体内取出。
2. 直接从胎儿心脏采集血液，以最大限度地减少微生物污染。
3. 将采集的血液离心，将血清与血凝块和血细胞分离。
4. 血清经过0.1微米的过滤器过滤，去除细菌、真菌和支原体，有效地对产品进行消毒。
5. 一些批次还接受伽马射线照射，以消除可以通过过滤的病毒和非常小的病原体。
6. 为了保持蛋白质和生物成分的完整性，在整个制造步骤中血清都保持冷冻状态。
7. 汇集和处理后，对血清批次的代表性样品进行无菌性和其他质量参数测试，然后放行。

细胞培养基中胎牛血清的最佳替代品

人血小板裂解物（HPL）

• 在再生医学中的作用：血小板对于伤口愈合和组织修复至关重要，因此其衍生物是再生医学的理想选择。
• 生长因子和细胞因子：血小板颗粒中储存着丰富的生长因子和细胞因子，这些因子和细胞因子可以通过凝血酶激活自然释放，也可以通过冻融、超声处理或化学处理人工释放。
• 细胞培养中的应用：HPL 已成为动物无血清细胞培养中 FBS 的可行替代品，支持先进的体细胞治疗和组织工程的有效人体细胞繁殖。
• 历史用途：1980世纪XNUMX年代，HPL首次用于培养成纤维细胞、内皮细胞和肿瘤细胞系。
• HPL的来源：约15-20%的全血捐献用于生产血小板浓缩物，其中5-20%的过期浓缩物可用于生产HPL。每年约有100亿份全血捐献，每年可从过期的血小板浓缩物中获取约100,000万至250,000万升HPL。

人血清白蛋白

• 潜在替代方案： 人类 AB 血清 (HABS) 已成为FBS的有前景的替代品。它定期进行病毒污染检测，并支持人类成骨细胞、软骨细胞、骨髓细胞以及神经胶质瘤和黑色素瘤等各种癌细胞系的生长。
• 限制：HABS 面临的主要挑战包括有限的收集能力以及与人类血液制品相关的风险，包括可能接触新的或未知的病原体。

无血清、无异源和化学成分明确的培养基

• 行业和学术努力： 学术界和产业界都致力于开发血清替代品，例如无血清、无异源成分和化学成分明确的培养基。这些替代品旨在为细胞培养提供可控且稳定的环境。
• 术语混淆：围绕这些介质的术语随着时间的推移而不断演变，导致行业内出现混乱。我们正在努力澄清和标准化这些替代方案的定义，以便更好地理解和应用。
• 常见误解（无异种成分≠无血清）

细胞培养基中使用的关键术语解释：

标签	定义	补充示例
无血清（SF）	♦ 否 初级原材料 来自血清、血浆或血淋巴。 ♦ 可能包括 生物材料 的条件，如 ♢ 牛垂体提取物 ♢ 血小板裂解物 ♢ 生长因子 ♢ 载体蛋白 ♦ 主要材料 可能来自血液/血清/血浆（例如白蛋白、转铁蛋白）。	♦ 动物/人类来源的补充剂（血小板裂解物、血清组分） ♦ 动物/植物水解物 ♦ 人类/动物来源或重组蛋白质、激素、生长因子和脂质的混合物
无动物成分 (ACF)	♦ 否 初级原材料 来自动物（包括人类）组织或体液。 ♦ 可能含有 重组动物蛋白 生产于： ♢ 动物细胞系 ♢ 发酵系统 ♦ 二次/三次材料 可能来自动物。	♦ 植物水解物 ♦ 由合格细胞系表达和加工的重组材料（蛋白质、激素、细胞因子和/或生长因子）的混合物
无异源物 (XF)	♦ 否 初级原材料 ，来自 非人类动物 或重组材料使用 非人类动物DNA. ♦ 可能含有： ♢ 人造材料 ♢ 来自人体细胞、植物、酵母或细菌的重组蛋白 ♦ 二次/三次材料 可能含有动物衍生成分。	♦ 人血清或血浆 ♦ 人类来源的补充剂（例如，人类血小板裂解物） ♦ 植物水解物 ♦ 人类衍生或重组蛋白质、激素、生长因子和脂质的混合物
化学定义（CD）	♦ 仅包含 化学成分明确的原材料 具有已知结构和浓度（例如盐、氨基酸、类固醇）。 ♦ 不包括 ♢ 蛋白质 ♢ 水解产物 ♢复杂/不明确的原材料 ♦ 不含任何来自动物（或人类）组织或体液的材料。	重组材料，如蛋白质、激素、细胞因子和/或生长因子。
无蛋白质	♦ 不含蛋白质或多肽 ♦ 可能包括：游离氨基酸、二肽、三肽（非动物来源） ♦ 植物、酵母或细菌水解物。	♦ 水解蛋白质（例如 HySoy） ♦ 胰岛素等小肽

CAR-T细胞生产中从FBS培养基过渡到无血清培养基

FBS 用于 CAR-T 细胞生产的挑战和伦理考量

• 含FBS的培养基仍然是全球GMP核心设施中最常用的
• 然而，FBS 成分与人类血清有显著差异，不能充分复制 CAR-T 细胞注射后在人体环境中的表现
• 出于伦理和环境方面的考虑，越来越多的 GMP 实验室正在优化含 HS 的培养基配方，用于 CAR-T 细胞生产

GMP生产中血清培养基的变异性和安全性问题

• 血清在 GMP 生产之前需要进行大量测试，这会导致成本增加。
• 人类血清提供的营养物质和生长因子更接近于人类微环境。
• 人血清和 FBS 均表现出供体依赖性差异，导致产品之间不一致
• 污染风险是一个关键问题：
  • FBS：可能传播牛海绵状脑病 (BSE) 和病毒病原体。
  • HS：病毒污染的风险
• 血清在 GMP 生产之前需要进行大量测试，这会导致成本增加。

 转向成分确定且无血清的培养基

• 在 CAR T 细胞生产中，使用确定培养基配方的趋势日益明显，其中可能包含或排除化学定义的无异种成分。
• 无血清培养基虽然不含血清，但可以包含纯化或合成的成分。

无血清培养基的支持证据

史密斯等人。 证明：

• 无异种培养基与添加 HS 或 FBS 的培养基中的 T 细胞扩增率相当。
• 无异种培养基中中央记忆T细胞的百分比更高。
• 两种培养基中慢病毒转导的 T 细胞生长相似。
• Coeshott 等人使用无异种培养基在功能封闭的自动化生物反应器系统中成功大规模扩增 T 细胞，扩增后中央记忆 T 细胞数量增加。

在此背景下， 幸人简介“ 用于T细胞扩增的无血清培养基 以及 T细胞活化和扩增培养基 可进一步增强CAR-T细胞的生产。该培养基采用特殊配方，可促进活化和扩增，支持高效T细胞活化和强劲生长。Kohjin Bio的培养基配方有助于简化生产流程，提高可扩展性，同时保持治疗应用所必需的高质量T细胞群。

细胞治疗中无血清培养基的监管标准

• “cGMP 级”血清这一术语常常具有误导性。
• 在欧盟 (EU)，监管机构强调原材料的生产并未完全遵循 cGMP (现行良好生产规范) 指南。
• 欧盟仅向生产活性药物成分和最终药品的设施颁发 cGMP 许可证，而不是向生产血清等原材料的设施颁发 cGMP 许可证。

为什么强大的质量体系对于无血清培养基生产至关重要

• 即使原材料不是按照 cGMP 生产的，但 健全的质量体系 至关重要。
• 适当的质量体系可确保：
• 详细记录制造过程。
• 机制 切换控制 跟踪程序中的任何调整。

细胞治疗供应链中质量体系的隐藏局限性

• 拥有质量体系并不能自动保证最终原材料的质量。
• 最终细胞治疗产品的安全性和有效性的最终责任在于细胞治疗制造商。
• 因此，制造商必须自己审核和批准原材料供应商的质量体系。

保证无血清培养基质量稳定的关键工艺设计策略

• 制造商应评估供应商的工艺设计是否包括：
• 如有必要，采取减少或消除病毒的措施。
• 生产过程中严格控制温度。
• 过程监控和控制措施。
• 最新的流程验证研究以确保一致性。

为什么单靠供应商质量控制不足以保证细胞疗法的合规性

• 供应商的质量控制测试可能无法满足细胞疗法开发商的所有需求。
• 典型的供应商质量控制测试包括：
• 总蛋白质含量。
• 免疫球蛋白水平。
• 无菌测试。
• pH 值测量。
• 渗透压测试。
• 然而，这些基本测试可能不足以满足临床应用的需求。

补充测试：超越供应商质量控制的关键一步

• 开发人员通常需要执行额外的功能分析，例如：
• 细胞生长性能测试。
• 标记表达分析。
• 活动分析，取决于应用程序。

伽马射线如何影响血清质量和细胞治疗效果

• 质量控制测试通常在伽马射线辐照之前进行。
• 由于辐照会改变血清的性能，因此辐照后质量保证策略对于验证血清是否仍然符合要求的规格至关重要。

符合法规要求的无血清培养基的认证和文档必备资料

• 除了拥有质量体系和质量控制验证外，供应商还应提供：
• 适用性证书 欧洲药品和保健质量管理局 (EDQM) 关于传染性海绵状脑病 (TSE) 的风险。
• 详细说明原材料来源的原产地证书。
• 不同国家可能会施加额外的测试要求和规范。
• 确定产品的目标市场并确保遵守当地卫生部门的规定至关重要。

根据 FDA 对细胞疗法制造的期望（21 CFR 1271、cGMP、BLA 提交），开发商还应解决常见的挑战，包括：

• 为目标细胞类型选择合适的无血清培养基。
• 调整因素来调节细胞生长率和倍增时间。
• 使用附着因子来支持接种后的初始细胞粘附。
• 将无血清培养基补充剂和方案与培养表面和细胞类型相结合。
• 优化细胞接种密度。
• 管理细胞特征的变化，例如分泌组、分化特征、细胞大小或免疫相关特性。
• 监测表面标志表达或分布的变化。
• 制定使细胞过渡到无血清条件的适应策略。
• 在无血清培养基中建立初级分离方法。
• 确保适当的培养基保质期和储存（例如温度、光敏感性）。
• 考虑不同培养系统对细胞粘附和剪切应力的影响。

结语

在细胞治疗中，从胎牛血清 (FBS) 培养基转向无异种成分和无血清培养基，解决了伦理、安全和监管方面的担忧，但在可扩展性和一致性方面也面临挑战。持续创新对于提高这些培养基的商业可行性，并支持可持续、安全的细胞疗法的发展至关重要。

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案例

1. Smith C 等人 (2015)。使用新型无异种成分 CTS 免疫细胞血清替代品体外扩增人 T 细胞用于过继免疫治疗。临床转化免疫学。16 月 4 日;1(31):eXNUMX。
2. Karnieli O 等人 (2017)。用于细胞治疗的血清替代品和无血清培养基的共识介绍。细胞疗法。二月；19(2)：155-169。
3. Coeshott C 等人 (2019) Quantum® 细胞扩增系统中 CD3+ T 细胞的大规模扩增和表征。《J Transl Med》7 月 17 日;1(258):XNUMX。
4. Alnabhan R 等人（2018）抗CD19嵌合抗原受体T细胞生产和扩增的培养基评估。细胞治疗。20:941–951。
5. Versteegen RJ, Murray J, Doelger S. (2021) 采集胎儿血液用于生产胎牛血清的动物福利与伦理。ALTEX。