间充质干细胞 (MSC) 具有分化能力和免疫调节特性，在再生医学领域具有巨大潜力。低温保存，即在超低温下储存细胞，对于维持治疗所需的 MSC 供应至关重要。然而，这个过程本身也带来了巨大的挑战。

在这篇博客中，我们将深入探讨与冷冻保存相关的关键挑战
MSCs并探索潜在的解决方案。

引言：MSC 生物库对未来治疗的重要性

冷冻保存 MSC 并创建 MSC 生物库是一种战略方法，可确保再生医学应用的高质量细胞随时可用。它允许标准化并减少对新鲜细胞分离的依赖。有几个令人信服的理由说明为什么冷冻保存 MSC 和创建生物库对于促进再生医学很重要：

• 随时可用的细胞： MSCs 通常是从骨髓或脂肪等组织中分离出来的。生物库中冷冻保存的 MSCs 可以免除每次治疗都获取新鲜细胞的麻烦，从而节省时间并减少患者的不适。这对于需要立即进行细胞治疗的情况尤其重要。
• 标准化质量： 冷冻保存可以创建具有明确特征的 MSCs 库。这些细胞可以在冷冻保存之前经过严格测试和鉴定，以确定其治疗潜力。这确保了临床使用的高质量 MSCs 来源的一致性和可靠性。
• 现成的疗法： 冷冻保存的 MSCs 生物库可以促进“现成”细胞疗法的发展。这些疗法不需要将特定的捐赠者与接受者进行匹配，从而克服了传统细胞疗法的局限性。
• 减少供体变异性： 从不同捐赠者处获得的 MSC 的特性和治疗效果可能有所不同。生物库可让研究人员和临床医生选择具有最理想特性的细胞用于特定应用。
• 长期储存： 冷冻保存可长期储存 MSC。这对于研究目的很有价值，可以为未来的研究保存有价值的细胞系，并有可能为子孙后代创造细胞疗法。
• 分享与协作： 生物库可以促进研究机构和公司之间的 MSCs 共享。这促进了合作并加速了新型细胞疗法的开发。

了解 MSC 培养中的冷冻保存挑战

冷冻保存是再生医学中的关键技术，可确保 MSCs 可用于治疗应用。然而，在这一关键过程中，研究人员和临床医生必须克服巨大的挑战。从冷冻保护剂毒性和功效之间的微妙平衡，到在冷冻和解冻过程中保持干细胞特性，保存 MSCs 的旅程充满了障碍。

• 细胞活力降低： 在冷冻过程中，细胞中的水会形成冰晶，冰晶会刺穿细胞膜并破坏内部结构，导致细胞死亡。冷冻过程中水分的去除会导致细胞内溶质浓度发生变化，从而产生渗透压，导致细胞收缩并破坏细胞成分。
• 冷冻保护剂的毒性： 二甲基亚砜 (DMSO)、甘油 (GLY)、乙二醇 (EG) 或丙二醇 (PG) 等冷冻保护剂 (CPA) 是必不可少的，因为它们有助于减少冰晶形成并保护细胞膜。虽然 CPA 是必不可少的，但它们在高浓度下可能会产生细胞毒性。找到冷冻保护和细胞毒性之间的最佳平衡至关重要。
• 干性丧失： ECM 为 MSC 保持其干细胞特性和分化潜能提供了重要线索。冷冻保存会破坏这些相互作用，从而可能影响 MSC 自我更新和分化为特殊细胞类型的能力。冷冻和解冻会改变 表观遗传景观 MSCs 是 DNA 上的化学修饰，可调节基因表达。这些变化会影响对干细胞和分化至关重要的基因的表达。
• 标准化问题： 不同实验室的冷冻保存方案差异很大，冷冻/解冻速率、冷冻保护剂浓度和细胞培养条件各不相同。这种不一致可能导致冷冻保存 MSCs 的细胞活力、干细胞特性和整体功能性方面的结果各不相同。由于缺乏标准化的质量控制措施，很难比较使用不同方案冷冻保存的 MSCs。建立健全的质量控制程序对于确保冷冻保存 MSCs 在临床应用中的安全性和有效性至关重要。

MSCs 冷冻保存的重要参数

由于冷冻过程会影响这些细胞的活力和功能，因此评估几个关键参数以确保成功冷冻保存 MSCs 至关重要，以确保冷冻保存的 MSCs 保留其在未来应用的治疗潜力。

• 免疫调节能力： 这是指 MSCs 调节免疫系统的能力。一个关键方面是它们对淋巴细胞或 外周血单核细胞（PBMC）. 检测可以测量细胞因子分泌或 T 细胞增殖 共同培养 与 MSCs。
• 细胞分化能力: MSC 具有分化成各种细胞类型的潜力。可以使用特定的染色技术来评估：
  • 油红O：检测脂质积聚，表明向脂肪细胞分化。
  • 茜素红：染色钙沉积物，是成骨细胞分化（骨细胞）的标志。
  • 阿尔新蓝：识别软骨细胞中存在的糖胺聚糖。
• 细胞活力: 测量冷冻保存后的活细胞比例非常重要。常见的检测方法包括：
  • 膜联蛋白V-碘化丙啶 (膜联蛋白V): 根据膜完整性和磷脂酰丝氨酸暴露来区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。
  • 活-死细胞染色 （例如， 钙黄绿素 AM/乙锭同型二聚体): 活细胞吸收绿色荧光染料（钙黄绿素 AM），而死细胞则被乙锭同型二聚体染成红色
• 细胞表型和增殖能力：MSC 有特定的表面标记。它们应表达 CD90、CD105 和 CD73，但缺乏与造血干细胞相关的标记，例如 CD34、CD19、CD45 和 CD14。流式细胞术通常用于评估这些标记。增殖能力可通过以下方法确定 细胞计数分析 或测量 DNA 合成。
• 生物安全和归巢/植入潜力：冷冻保存不会引发基因突变，也不会增加肿瘤形成的风险或 MSCs 迁移到损伤部位的能力。临床前 体内动物研究 可以评估这些风险。

成功冷冻保存 MSC 的策略

当研究人员努力确保冷冻保存的 MSC 的活力和功能时，他们遇到了一系列挑战。然而，在这些挑战中，研究人员正在寻找创新解决方案来优化冷冻保存过程：

• 工作区和试剂准备：在开始冷冻保存过程之前，必须确保工作空间和所有试剂都已准备好。使用 支原体喷雾剂 或其他合适的消毒剂以保持无菌环境。准备好所有必要的试剂，包括冷冻保护剂和生长培养基，并根据需要进行冷藏。这种准备可以最大限度地减少细胞暴露在次优条件下的时间，从而提高它们在冷冻和解冻过程中存活的机会。
• 精密冷却： 一个关键因素是冷却速度。长期储存前控制冷冻速度可最大程度地提高细胞活力。控制温度梯度的慢速冷冻可最大限度地减少冰晶形成，避免细胞受损。如果没有专用冷冻机，请考虑使用热控容器，例如以 -1℃/分钟稳定冷却速度的无酒精冷冻容器。重要的是确保 MSCs 以推荐的密度冷冻，通常在 5 x 10^5 细胞/毫升和 1 x 10^6 细胞/毫升之间，以在冷冻过程中保持其完整性。此外，始终使用无菌冷冻管储存细胞，确保在开始冷却过程之前正确标记并安全密封。
• 温度问题： 液氮储存在 -196°C 被认为是最佳温度。在这种超低温下，细胞进入代谢停滞状态，最大限度地降低细胞活动和损伤风险。对于较短的储存期（几个月），-80°C 可能是可以接受的。但是，对于长期冷冻保存（超过一年），强烈建议使用 -196°C。至关重要的是，在整个储存过程中（包括运输或取样过程中）保持一致的温度至关重要。热波动会显著影响解冻后的细胞健康。
• 快速解冻： 冷冻保存样品的复温速度会影响细胞活力，但通常不如控制冷却阶段那么严重。最常见的方法是将样品置于 37°C 的水浴中，直到所有冰晶消失。这种快速解冻可最大限度地减少细胞内结冰对细胞造成的潜在损害。
• 解冻后复苏策略： 解冻后，必须使用制备好的生长培养基稀释去除冷冻保护剂，然后进行离心。此外，提供具有必需生长因子的正确培养条件有助于解冻的 MSCs 恢复、恢复功能并茁壮成长。
• 平衡保护和毒性： 冷冻保护剂，如常用的含 DMSO 的冷冻介质，对于防止冻伤和确保解冻后细胞活力至关重要。然而，矛盾的是，它们具有潜在的细胞毒性，特别是在高浓度下。为了降低这种风险，研究人员正在探索 替代配方，例如将较低浓度的 DMSO 与无细胞毒性的生物相容性物质结合使用。例如，将 5% DMSO 与 95% 人血清白蛋白 已显示出在保持细胞完整性的同时最大程度降低细胞毒性作用方面的潜力。此外，正在进行的研究旨在开发利用天然生物材料力量的新型冷冻保护剂，这预示着一种更安全的方法，甚至可能完全消除对 DMSO 的需求。
• 封装以增强保护： 在冷冻保存期间将 MSCs 包裹在保护性水凝胶或其他生物材料中，可以提供额外的防御层来抵御细胞压力。有希望 进步 包括在高度疏水的纳米粗糙表面上将细胞封装在纳升液滴中冷冻，以及开发无毒、纳米级的仿生冷冻保护剂。

图1： 细胞产品的低温保存和冻融。（A)临床细胞产品冷冻和解冻过程中的相变。(B)细胞产品冷冻和解冻曲线的温度曲线。

来源：Cottle, C., Porter, AP., et. al., doi: 10.1007/s40778-022-00212-1

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用于细胞治疗的 MSC 冷冻保存培养基的 5 个必备特性

有效冷冻保存MSC对于确保其在临床应用中的活力和治疗潜力至关重要。选择合适的冷冻保存介质至关重要。以下是需要考虑的五个关键特征：

1. 无外来成分和化学成分明确的成分

为了符合GMP指南并降低免疫原性反应的风险，冷冻保存培养基应不含异源性成分，且最好是化学成分明确的。这样可以避免依赖胎牛血清 (FBS) 等动物源性成分，因为这些成分可能会引入变异性和潜在污染物，从而影响安全性和可重复性。

2. 解冻后高活力和恢复

冻存培养基的主要基准是解冻后能否保持较高的细胞活力。MSC不仅应保持膜的完整性，还应保持增殖能力和最低的细胞凋亡率。培养基应进行优化，以保护细胞免受冰晶形成和渗透压休克的影响，从而保持其治疗效力。

3. MSC 身份和功能的保留

解冻后，MSC 必须保留其定义性特征，例如表面标志物表达（CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺，造血标志物阴性）、分化潜能和免疫调节特性。合适的冻存培养基即使在长期储存后也能维持这些功能和表型特征。

4. 与GMP生产工作流程的兼容性

可扩展性和合规性对于细胞治疗产品至关重要。理想的冻存介质应采用GMP级配方，最好经过无菌过滤和内毒素检测，并且能够无缝集成到自动化或半自动化处理流程中。

5. 灵活的储存和解冻条件

可靠的冷冻保存介质应具备灵活的储存时间和温度（例如，短期使用气相氮气或-80°C）。其配方也应尽量减少在严格条件下快速解冻的需求，从而简化操作并降低临床环境中的差异性。

聚焦：CryoEase-PF – 推进 MSC 冷冻保存

体现所有这些基本功能的一款优秀产品是 CryoEase-PF-一个 完整、即用型培养基 专为 尽量减少细胞压力 在冷冻、解冻和低温储存过程中。其专有配方有助于 减少冰晶的形成，防止对细胞造成机械损伤。此外，它 维持渗透平衡 尽量减少细胞收缩和肿胀，创造一个 稳定的微环境 保护 MSCs 免受氧化和代谢压力。

• 不含 DMSO 和蛋白质： 消除了通常与 DMSO 等传统冷冻保护剂相关的细胞毒性作用，减少了解冻后处理的需要并最大限度地减少了细胞损失。

• 双温度兼容性： 适用于低温和低温储存（4-10°C），为各种物流场景中的细胞运输和储存提供无与伦比的灵活性。

• 高生存力和恢复力： 经证实，在 85°C 下 72 小时后仍能维持 4% 以上的细胞活力，同时根据 ISCT 临床级 MSCs 标准保持增殖能力和表面标志表达。

• 促进临床转化： 虽然 CryoEase-PF 不是在经过 GMP 认证的工厂生产的，但它采用符合 GMP 标准的材料制成，并在严格的质量控制下生产，使其成为临床前和早期转化研究的有力候选者。

CryoEase-PF 为寻求保持 MSC 质量和功能的实验室提供强大、用户友好的解决方案，其配方有效地弥合了研究和临床应用之间的差距。

总结

尽管面临挑战，冷冻保存仍然是推进 MSC 疗法的重要工具。制定实验室标准化的冷冻保存方案至关重要。强大的质量控制措施可确保结果一致且安全，为冷冻保存 MSC 的可靠临床应用铺平道路。

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参考文献：

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