7 con số quan trọng trong nuôi cấy tế bào mà mọi nhà nghiên cứu cần biết

7 con số quan trọng trong nuôi cấy tế bào mà mọi nhà nghiên cứu cần biết

Nhà khoa học thực hiện nuôi cấy tế bào trong điều kiện phòng thí nghiệm vô trùng, đánh giá khả năng sống và độ hợp lưu của tế bào trong đĩa petri; hình ảnh thể hiện các phương pháp tốt nhất trong nuôi cấy tế bào, các thông số quan trọng như độ pH và mức độ nội độc tố trong FBS, và các kỹ thuật duy trì tế bào động vật có vú khỏe mạnh với mật độ gieo hạt được tối ưu hóa, khả năng tái tạo nghiên cứu và các giao thức thử nghiệm mycoplasma.

7 con số quan trọng trong nuôi cấy tế bào mà mọi nhà nghiên cứu cần biết

Mục lục

Nuôi cấy tế bào có vẻ đơn giản khi bạn đã nắm vững những điều cơ bản — chuẩn bị bình, nuôi tế bào, truyền ở điểm hợp lưu — nhưng sự xuất sắc thực sự nằm ở những chi tiết tinh tế. Những sai lệch nhỏ trong các thông số chính có thể gây ra sự không nhất quán lớn trong các thí nghiệm của bạn, dẫn đến sự thay đổi không mong muốn, mất kiểu hình tế bào hoặc thậm chí là thất bại trong xét nghiệm.

Không chỉ là về kỹ thuật: các vật liệu bạn sử dụng, chẳng hạn như môi trường cơ bản của bạn (như DMEM, RPMI, hoặc là MEM) và các chất bổ sung như huyết thanh thai nhi bò (FBS), đóng vai trò quan trọng trong việc ảnh hưởng đến hành vi của tế bào. Sự thay đổi trong thành phần môi trường, chất lượng mẻ huyết thanh hoặc điều kiện nuôi cấy có thể ảnh hưởng đáng kể đến tốc độ tăng trưởng, khả năng sống, hình thái và khả năng tái tạo thực nghiệm. Ngay cả khi sử dụng các thương hiệu đáng tin cậy, việc theo dõi và tối ưu hóa môi trường nuôi cấy của bạn vẫn là điều cần thiết.

Cho dù bạn đang làm việc với tế bào sơ cấp, tế bào gốc trung mô hay dòng tế bào bất tử, việc hiểu và theo dõi các số liệu nuôi cấy cụ thể sẽ đảm bảo sức khỏe của tế bào, cải thiện khả năng tái tạo và củng cố kết quả thử nghiệm của bạn.

Trong bài viết này, chúng tôi nêu bật bảy con số quan trọng mỗi nhà nghiên cứu nên theo dõi — và giải thích lý do tại sao chúng quan trọng để đạt được kết quả nhất quán và chất lượng cao.

Đồ họa thông tin cho thấy 7 số liệu nuôi cấy tế bào quan trọng mà mọi nhà nghiên cứu nên theo dõi, bao gồm số lần truyền, mật độ gieo hạt tế bào, tỷ lệ hợp lưu, tỷ lệ sống, tần suất xét nghiệm mycoplasma, phạm vi pH của môi trường nuôi cấy và mức độ nội độc tố. Có các biểu tượng được gắn nhãn cho từng thông số màu xanh ngọc trên nền sáng, nhấn mạnh vào các tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng nuôi cấy tế bào thiết yếu.
Hình ảnh trang trí có chữ: Số lượng đoạn văn/dân số tăng gấp đôi

1. Số lượng vượt qua / Dân số tăng gấp đôi

số đoạn văn phản ánh số lần một quần thể tế bào đã được văn hóa phụ (chia tách và gieo lại vào các mạch mới) kể từ khi cô lập hoặc hồi sinh ban đầu từ quá trình bảo quản lạnh. Mỗi lần truyền đánh dấu một vòng mở rộng và nhân giống tế bào.

Mặc dù số lượng đoạn văn thường được coi là một số liệu thông thường, nhưng nó đóng vai trò quan trọng trong việc xác định chất lượng tế bào, hiệu suất và khả năng tái tạo thử nghiệm. Theo thời gian, các tế bào tích lũy những thay đổi về phân tử và biểu sinh trong ống nghiệm văn hóa. Những thay đổi này có thể dẫn đến những thay đổi đáng kể trong hành vi, chẳng hạn như biểu hiện gen thay đổi, tăng sinh chậm hơn, khả năng sống giảm hoặc sự biệt hóa không mong muốn — ngay cả khi hình thái tế bào không thay đổi.

Tại sao chúng ta cần theo dõi và ghi lại số lượng tế bào di chuyển?

Việc theo dõi và ghi lại số lần đi qua đảm bảo:

  • Sự nhất quán giữa các thí nghiệm:Sử dụng các ô có số lần chuyển đoạn khác nhau có thể gây ra sự thay đổi trong dữ liệu của bạn.
  • Hành vi có thể dự đoán được: Các tế bào hoạt động nhất quán hơn trong một cửa sổ chuyển tiếp được xác định. Ngoài ra, chúng có thể biểu hiện dấu hiệu lão hóa hoặc trôi dạt di truyền.
  • Tuân thủ và khả năng truy xuất nguồn gốc:Trong quy trình làm việc GMP hoặc nghiên cứu chất lượng xuất bản, cần phải có khả năng truy xuất nguồn gốc đầy đủ quá trình xử lý tế bào — bao gồm cả lịch sử truyền tế bào.
  • Quyết định:Biết được số đoạn văn giúp các nhà nghiên cứu quyết định thời điểm tạo ra các nguồn giống mới, loại bỏ các nền văn hóa cũ hoặc khắc phục sự cố về những thay đổi trong kiểu hình.

Không theo dõi số lượng đoạn văn có thể dẫn đến kết quả không thể tái tạo, kết luận sai lệchtài nguyên lãng phí — đặc biệt là trong các nghiên cứu dài hạn hoặc các quy trình phát triển tiền lâm sàng.

Thế nào là một đoạn văn?

Trong nuôi cấy tế bào thông thường, mỗi lần nuôi cấy hoặc gieo lại được coi là một lần truyền.

Tuy nhiên, có một câu hỏi thường gặp:
Việc rã đông tế bào đông lạnh có được tính là một quá trình chuyển hóa mới không?
Câu trả lời là Không — số đoạn văn phải tăng lên làm giống, không phải trên đông lạnh.

Ví dụ:
Nếu bạn có một dòng tế bào đang hoạt động tại đoạn văn 1 (P1)và bạn trypsin hóa và đông lạnh các tế bào này, bạn dán nhãn lọ là P2. Khi rã đông, chúng vẫn còn P2 cho đến khi bạn nuôi cấy chúng lại, tại thời điểm đó chúng trở thành P3.

Sơ đồ từng bước minh họa việc xác định số lượng tế bào truyền qua trong quá trình đông lạnh và nuôi cấy. Quá trình bắt đầu với một đĩa nuôi cấy có nhãn "P=1" (Lượt 1), được ghi chú là vật liệu làm việc. Các tế bào được trypsin hóa và bảo quản đông lạnh trong các lọ có nhãn "P=2". Sau khi rã đông, các lọ này được sử dụng để gieo hạt vào một đĩa nuôi cấy mới vẫn được dán nhãn "P=2". Sau khi nuôi cấy, các tế bào trở thành Lượt 3 (P=3), được thể hiện trong một đĩa mới và một số lọ đông lạnh. Một đĩa được chỉ định là vật liệu làm việc để nuôi cấy và thử nghiệm, trong khi nhiều lọ P=3 được dán nhãn là vật liệu để đông lạnh. Các mũi tên chỉ hướng của quy trình làm việc từ P=1 đến P=3.
Hình 1: Xác định số lượng truyền từ đàn đông lạnh sang các nền văn hóa phụ tiếp theo

Tại sao chỉ số đoạn văn là không đủ

Số đoạn văn không tính đến tỷ lệ phân chia hoặc mật độ gieo hạtvà do đó chỉ cung cấp cái nhìn hạn chế về số lần tế bào thực sự phân chia.

Hãy xem xét tình huống này:

  • Nhà nghiên cứu A chia một nền văn hóa ở P10 theo tỷ lệ 1:4.
  • Nhà nghiên cứu B chia cùng một nền văn hóa ở P10 theo tỷ lệ 1:10.
  • Cả hai đều dán nhãn bình tiếp theo là P11.

Tuy nhiên, các tế bào phân chia 1:10 phải tăng sinh nhiều hơn để đạt đến điểm hợp lưu, nghĩa là chúng trải qua nhiều sự nhân đôi dân số (PD) hơn. Theo thời gian, điều này có thể dẫn đến các tế bào khác nhau về mặt di truyền và chức năng, mặc dù số lần di chuyển của chúng giống hệt nhau.

Tại sao theo dõi PD lại quan trọng

  • Chính xác hơn: Phản ánh lịch sử sao chép thực sự, đặc biệt khi tỷ lệ phân chia thay đổi.
  • Thông báo ngưỡng lão hóa: Đặc biệt quan trọng đối với tế bào sơ cấp và MSC, nơi chức năng suy giảm do sự sao chép quá mức.
  • Tăng cường khả năng so sánh: Hữu ích khi so sánh kết quả giữa các nhà tài trợ, công thức môi trường hoặc phòng thí nghiệm khác nhau.
  • Hỗ trợ nghiên cứu chuyển dịch: Cần thiết cho việc lập tài liệu quản lý và khả năng tái tạo trong quy trình làm việc cấp độ lâm sàng.

Việc theo dõi PD cùng với số lần truyền và thời gian nhân đôi cung cấp một góc nhìn đa chiều về sức khỏe văn hóa, cho phép đưa ra quyết định tốt hơn, đặc biệt là trong các nghiên cứu dài hạn hoặc nghiên cứu chuyển dịch.

Hình ảnh trang trí có chữ: Mật độ gieo hạt tế bào

2. Mật độ gieo hạt tế bào

Mật độ gieo hạt tế bào — số lượng tế bào được mạ trên một đơn vị diện tích (đối với tế bào bám dính) hoặc trên một đơn vị thể tích (đối với tế bào treo) — là tham số cơ bản trong nuôi cấy tế bào. Nó ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ tăng trưởng, hình thái, biểu hiện gen và kết quả của các xét nghiệm tiếp theo.

Gieo hạt không đúng cách có thể dẫn đến:

  • Quá hợp lưu, gây ức chế tiếp xúc, thay đổi tín hiệu hoặc lão hóa sớm
  • Mật độ thấp, có thể gây căng thẳng cho tế bào, làm chậm sự phát triển hoặc thay đổi hành vi
  • Biến thiên thực nghiệm, đặc biệt trong các xét nghiệm phụ thuộc vào tương tác tế bào-tế bào, các yếu tố tiết ra hoặc tín hiệu phân hóa

Việc duy trì mật độ gieo hạt thích hợp sẽ đảm bảo:

  • Phân bố tế bào và bám dính đồng đều (đối với tế bào bám dính)
  • Tiếp cận dinh dưỡng và oxy tối ưu
  • Sự nhất quán giữa các lần lặp lại và thời điểm
  • Duy trì các chức năng và kiểu hình chính của tế bào

Phạm vi điển hình

Loại tế bàoMật độ gieo hạt khuyến nghị
Tế bào bám dính5,000–50,000 tế bào/cm²
Tế bào treo× 2 104 đến 5 × 105 tế bào / mL

Đây chỉ là phạm vi chung. Mật độ tối ưu thay đổi tùy theo loại tế bào, loại xét nghiệm, kích thước bình nuôi cấy và mục tiêu thử nghiệm.

Pro Mẹo: Người ta khuyến cáo nên cấy nhiều tế bào hơn ngay sau khi rã đông so với quá trình cấy truyền thông thường, vì khả năng sống của tế bào sau khi rã đông thường thấp hơn.

Các yếu tố ảnh hưởng đến mật độ gieo hạt tế bào

Yêu cầu về mật độ tế bào khác nhau rất nhiều tùy thuộc vào:

  • Loại tế bào – Một số tế bào (ví dụ, tế bào thần kinh nguyên phát hoặc tế bào nội mô) cần sự tiếp xúc chặt chẽ giữa các tế bào để tồn tại, trong khi những tế bào khác (ví dụ, nguyên bào sợi) chịu được sự gieo hạt có mật độ thấp.
  • Ứng dụng - Xét nghiệm tăng sinh đòi hỏi mật độ ban đầu thấp, trong khi phân biệt có thể đòi hỏi sự hợp lưu ban đầu cao hơn.

Tham khảo tài liệu đã xuất bản và thực hiện các thí nghiệm thí điểm để xác định mật độ gieo hạt phù hợp nhất cho hệ thống cụ thể của bạn. Những gì hiệu quả với một phòng thí nghiệm hoặc dòng tế bào có thể không áp dụng cho phòng thí nghiệm hoặc dòng tế bào khác.

Cách tính mật độ gieo hạt

Sau đây là hướng dẫn nhanh giúp bạn tính toán mật độ gieo hạt phù hợp cho thí nghiệm của mình:

  1. Xác định mật độ gieo hạt mong muốn — ví dụ, tế bào X/cm²
  2. Đếm tế bào của bạn sử dụng máy đếm tế bào hoặc máy đếm tự động
  3. Tính tổng số ô cần thiết bằng cách nhân X với tổng diện tích bề mặt của tàu của bạn
  4. Máy ly tâm huyền phù tế bào của bạn và tái huyền phù viên trong một thể tích nhỏ hơn đã biết (ví dụ: 1 mL) — gọi thể tích này là Y
  5. Tính khối lượng cần đạt được mật độ gieo hạt mong muốn bằng cách sử dụng:
Phương trình: X lần diện tích bề mặt chia cho nồng độ tế bào trong Y bằng Z mL tế bào được tái huyền phù. Được sử dụng để tính toán lượng thể tích huyền phù tế bào cần thiết để gieo hạt.

Ví dụ: Bạn cần 2 × 10⁵ tế bào/giếng trong đĩa 6 giếng. Nếu bạn có 1 × 10⁶ tế bào/mL, bạn sẽ cần 0.2 mL cho mỗi giếng.

Ví dụ: 2 × 10⁵ tế bào trên một giếng chia cho 1 × 10⁶ tế bào trên một mL bằng 0.2 mL trên một giếng. Điều này cho thấy cách tính thể tích cần thiết để gieo tế bào từ một nồng độ đã biết.
Hình ảnh trang trí có chữ: Tỷ lệ hợp lưu

3. Tỷ lệ hợp lưu

Sự hợp lưu của tế bào đề cập đến tỷ lệ phần trăm bề mặt nuôi cấy được bao phủ bởi các tế bào bám dính. Đây là chỉ báo trực quan nhanh chóng và cần thiết về sự phát triển của tế bào và sức khỏe nuôi cấy nói chung.

Không chỉ là một phép đo thông thường, sự hợp lưu được sử dụng để hướng dẫn các quyết định trong toàn bộ quy trình nuôi cấy tế bào—từ truyền và bảo quản đông lạnh đến xử lý thử nghiệm và phân biệt. Điều quan trọng là, hành vi tế bào, biểu hiện genkhả năng phản ứng với các kích thích bên ngoài tất cả đều chịu ảnh hưởng rất lớn bởi mức độ hợp lưu.

Sự hợp lưu tế bào là gì?

Sự hợp lưu không phải là số lượng tế bào trực tiếp, mà là ước tính trực quan về độ che phủ bề mặtVí dụ, bình chứa 70% chất lỏng có 70% diện tích bề mặt bị chiếm bởi các tế bào bám dính.

Khi sử dụng đúng cách, sự hợp lưu sẽ giúp xác định:

  • Khi nào thì tách hoặc chuyển tế bào
  • Thời điểm tốt nhất để chuyển gen hoặc điều trị bằng thuốc
  • Cho dù nền văn hóa có phù hợp với các ứng dụng hạ nguồn như phân biệt, lập trình lại hay thu hoạch hay không
Sơ đồ cho thấy 4 trường quan sát dưới kính hiển vi của các tế bào được mô tả ở mức hợp lưu 20%, 50%, 80% và 100%.
Hình 2: Sơ đồ cho thấy 4 trường quan sát dưới kính hiển vi của các tế bào được mô tả ở mức hợp lưu 20%, 50%, 80% và 100%.
Tham khảo: Cơ bản và giao thức nuôi cấy tế bào

Rủi ro của sự hội tụ quá mức

Không đi qua đúng thời điểm có thể dẫn đến:

  • cạn kiệt chất dinh dưỡngcăng thẳng trao đổi chất
  • Các tế bào đang đi vào ngừng tăng trưởng, lão hóa hoặc chết rụng tế bào
  • Tích lũy mảnh vụn tế bào độc hại từ các tế bào chết
  • Thay đổi hình thái và biểu hiện gen mà trình bày sai lệch trong cơ thể điều kiện
  • Cao hơn nguy cơ ô nhiễm, đặc biệt là nấm hoặc vi khuẩn

Tại sao ước tính chính xác là quan trọng

Mặc dù có tầm quan trọng, độ hợp lưu vẫn thường được ước tính bằng mắt dưới kính hiển vi. "Phép ước tính" này mang tính chủ quan và có thể khác nhau giữa những người dùng—kể cả đối với cùng một người vào những ngày khác nhau. Việc ước tính độ hợp lưu từ 60–90%, phạm vi quan trọng nhất đối với nhiều quy trình, đặc biệt dễ xảy ra lỗi.

Ước tính chính xác và nhất quán về sự hợp lưu hỗ trợ:

  • Khả năng tái lập: Đảm bảo các tế bào ở cùng trạng thái sinh lý trong các thí nghiệm
  • Hiệu quả: Tránh lãng phí thuốc thử và quy trình làm việc không thành công do hành động không đúng thời điểm
  • Tính hợp lệ thực nghiệm: Đảm bảo quá trình chuyển gen và xử lý thuốc được thực hiện trong điều kiện tăng trưởng tối ưu
Các Ứng DụngSự hội tụ mục tiêulý do
Xét nghiệm tăng sinh60 tầm 80%Đảm bảo tăng trưởng tích cực
Chuyển gen/Chuyển đổi gen70 tầm 90%Cân bằng khả năng sống và hấp thụ tối ưu
Sự khác biệtThay đổi tùy theo loại tế bàoMột số yêu cầu mật độ cao; những cái khác yêu cầu không gian cho những thay đổi hình thái
Bảo quản lạnh70 tầm 90%Chuẩn bị tế bào ở trạng thái khỏe mạnh nhất để phục hồi sau khi rã đông
Sự giãn nở sau khi rã đông50 tầm 70%Ngăn ngừa tình trạng quá tải và hỗ trợ tái sinh khỏe mạnh

Mẹo chuyên nghiệp để ước tính độ hội tụ tốt hơn

  • Sử dụng hình ảnh tham khảo để đào tạo và chuẩn hóa
  • Giữ một bản ghi hình ảnh về các giai đoạn hợp lưu điển hình
  • Sử dụng các công cụ định lượng như ImageJ hoặc phần mềm phân tích sự hợp lưu khi có thể
  • Áp dụng hệ thống hình ảnh tự động để theo dõi khách quan

Chiến lược ngăn ngừa sự hội tụ quá mức

Sự quá hợp lưu là một vấn đề có thể phòng ngừa được, có thể làm chệch hướng toàn bộ các thí nghiệm. Sử dụng các chiến lược chủ động sau:

  1. Giám sát thường xuyên: Kiểm tra các nền văn hóa của bạn hàng ngày dưới kính hiển vi và ghi lại các quan sát. Sự tăng trưởng đột biến bất ngờ có thể xảy ra nhanh chóng.
  2. Tối ưu hóa mật độ gieo hạt: Bắt đầu với quá nhiều tế bào có thể dẫn đến tình trạng phát triển quá mức nhanh chóng. Điều chỉnh mật độ gieo hạt theo loại tế bào, kích thước mạch và ứng dụng của bạn.
  3. Sử dụng bình nuôi cấy lớn hơn: Nếu việc di chuyển thường xuyên trở nên nặng nề, việc tăng kích thước bình hoặc đĩa lớn hơn có thể làm giảm tần suất xử lý.
  4. Điều chỉnh tần suất thay đổi phương tiện: Các tế bào phát triển nhanh có thể làm cạn kiệt chất dinh dưỡng nhanh chóng. Việc thay đổi môi trường thường xuyên hơn có thể giúp duy trì khả năng sống và làm chậm sự hợp lưu.
  5. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy: Đảm bảo mức CO₂, độ ẩm và nhiệt độ thích hợp. Các tế bào chịu áp lực có thể hoạt động không thể đoán trước, ảnh hưởng đến động lực tăng trưởng.
  6. Thiết lập SOP và ngưỡng: Xác định ngưỡng hợp lưu rõ ràng trong các giao thức của bạn—ví dụ: “Các tế bào đạt ngưỡng hợp lưu 80%”—để cải thiện tính nhất quán trong toàn bộ phòng thí nghiệm.
Hình ảnh trang trí có chữ: Tỷ lệ khả thi

4. Tỷ lệ sống

Khả năng di động là một chỉ số quan trọng về sức khỏe tổng thể của tế bào và rất quan trọng để đảm bảo kết quả thử nghiệm đáng tin cậy và có thể tái tạo. Cho dù bạn đang tiến hành chuyển gen, thử nghiệm thuốc, nghiên cứu biệt hóa hay chuẩn bị tế bào để bảo quản đông lạnh, việc duy trì tỷ lệ sống cao sẽ giúp đảm bảo kết quả nhất quán và có liên quan về mặt sinh lý.

Khả năng sống thấp có thể:

  • Làm sai lệch kết quả xét nghiệm do sự can thiệp của tế bào chết hoặc sắp chết
  • Kích hoạt phản ứng căng thẳng làm thay đổi biểu hiện gen và protein
  • Hiệu quả truyền nhiễm hoặc lây nhiễm thấp hơn
  • Gây ra sự không nhất quán giữa các lô làm giảm khả năng tái tạo

Ngưỡng mục tiêu

  • Một nuôi cấy tế bào khỏe mạnh được đặc trưng bởi Từ 80-95%và thường được khuyến nghị cho hầu hết các thí nghiệm tiêu chuẩn.
  • Hướng dẫn của FDA: Trong cáp ex vivo tế bào biến đổi gen (ví dụ, CAR-T, MSC), FDA khuyến nghị mức khả năng sống tối thiểu là 70%. Nếu thấp hơn, dữ liệu hỗ trợ phải cho thấy nó không ảnh hưởng sự an toàn, hiệu quả, hoặc là giao hàngvì tế bào chết hoặc mảnh vụn có thể ảnh hưởng đến kết quả điều trị.

Cách đánh giá khả năng tồn tại

  • Loại trừ Trypan Blue: Phương pháp đếm thủ công đơn giản sử dụng máy đếm tế bào hoặc máy đếm tự động.
  • Đo lưu lượng tế bào với thuốc nhuộm khả năng sống (ví dụ: PI, 7-AAD): Cho phép phân tích đa tham số.
  • Xét nghiệm huỳnh quang hoặc đo màu (ví dụ, MTT, Resazurin): Thích hợp cho sàng lọc thông lượng cao.

Vai trò của FBS trong khả năng sống của tế bào

FBS là một trong những thành phần quan trọng nhất trong nhiều công thức môi trường nuôi cấy. Nó cung cấp các yếu tố tăng trưởng thiết yếu, hormone, phân tử kết dínhvà các chất dinh dưỡng hỗ trợ bám dính tế bào, tăng sinh và sống sót.

Sử dụng FBS đáng tin cậy, chất lượng cao rất quan trọng để duy trì khả năng sống vì:

  • FBS kém chất lượng hoặc thay đổi có thể dẫn đến hành vi tế bào không thể đoán trướckhả năng tồn tại thấp.
  • FBS bị ô nhiễm hoặc không được khử hoạt tính bằng nhiệt đúng cách có thể gây ra tác dụng gây độc tế bào.
  • Sự thay đổi theo từng đợt trong FBS có thể tạo ra sự không nhất quán trong kết quả thử nghiệm trừ khi FBS là được kiểm tra và xác nhận nghiêm ngặt.

Pro Mẹo – Luôn lấy FBS từ các nhà cung cấp có uy tín cung cấp:

  • CHỨNG NHẬN không có virus và mycoplasma sản phẩm
  • Chứng minh tính nhất quán của lô với các tùy chọn kiểm tra trước
  • Nguồn gốc có thể truy xuấtbộ sưu tập đạo đức thực hành

Nguyên nhân phổ biến của khả năng sống thấp

  • Chu kỳ rã đông hoặc đông lạnh-rã đông không tối ưu
  • Nuôi cấy quá mức dẫn đến cạn kiệt chất dinh dưỡng
  • Tách enzyme khắc nghiệt
  • Sự ô nhiễm (ví dụ, mycoplasma, nội độc tố)
  • Chất lượng phương tiện truyền thông kém hoặc các chất bổ sung không phù hợp như FBS không ổn định hoặc không nhất quán

Mẹo để cải thiện khả năng sống của tế bào

  • Sử dụng môi trường hoàn chỉnh, được làm ấm trước với FBS chất lượng cao
  • Tránh xử lý quá mức hoặc để tế bào ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài
  • Tối ưu hóa các điều kiện tách enzyme
  • Duy trì thích hợp mật độ gieo hạt sau khi rã đông để thúc đẩy phục hồi
  • Thực hiện QC thường quy (ví dụ, thử nghiệm mycoplasma, pH môi trường, kiểm tra thẩm thấu)

Khả năng sống cao không chỉ là sống sót mà còn là đảm bảo các tế bào của bạn khỏe mạnh, hoạt động và hoạt động như mong đợi. Thuốc thử đáng tin cậy như FBS được chứng nhận tạo thành xương sống của một hệ thống nuôi cấy đáng tin cậy.

Hình ảnh trang trí có chữ: Tần suất xét nghiệm Mycoplasma

5. Tần suất xét nghiệm Mycoplasma

Nhiễm trùng Mycoplasma là một trong những vấn đề nguy hiểm và ít được chẩn đoán nhất trong nuôi cấy tế bào. Không giống như nhiễm khuẩn hoặc nấm, mycoplasma không gây đục môi trường và thường không được chú ý—trong khi âm thầm phá hoại tính toàn vẹn của thí nghiệm.

Những loại vi khuẩn nhỏ không có thành tế bào này có thể:

  • Thay đổi quá trình trao đổi chất, tăng sinh và biểu hiện gen của tế bào
  • Can thiệp vào hiệu quả chuyển gen và phản ứng cytokine
  • Làm giảm khả năng tái tạo và dẫn đến kết luận thực nghiệm sai lầm
  • Không bị phát hiện trong nhiều tuần hoặc nhiều tháng, đặc biệt là trong các lồng ấp hoặc phòng xét nghiệm chung
Tình hìnhTần suất kiểm tra
Bảo trì nuôi cấy tế bào thường xuyênCứ 4–6 tuần một lần
Trước khi thử nghiệm quan trọngÍt nhất 1 tuần trước
Trước khi bảo quản đông lạnh tế bàobắt buộc
Sau khi rã đông tế bào từ nơi lưu trữTrong vòng 3–5 ngày sau khi rã đông
Sau khi nhận được dòng tế bào mớiNgay khi đến nơi
Sau khi điều trị bằng kháng sinh hoặc nghi ngờ bị nhiễm bẩnCần phải kiểm tra theo dõi

Các tình huống rủi ro cao cần được giám sát thường xuyên

  • Phòng thí nghiệm chung hoặc phòng thí nghiệm cốt lõi môi trường
  • Văn hóa lâu dài thí nghiệm
  • Phòng thí nghiệm làm việc với tế bào gốc hoặc tế bào sơ cấpS
  • Phòng thí nghiệm sử dụng hợp nhất hoặc đồng văn hóa
  • Các cơ sở chuẩn bị tế bào cho sử dụng lâm sàng hoặc tiền lâm sàng

Phương pháp kiểm tra

  • Bộ dụng cụ dựa trên PCR: Nhanh, nhạy và được sử dụng rộng rãi
  • nhuộm DNA (ví dụ, Hoechst 33258): Hữu ích cho việc phát hiện dựa trên kính hiển vi
  • Xét nghiệm bằng enzym: Nhanh chóng và đơn giản cho việc sàng lọc thường quy
  • Xét nghiệm dựa trên nuôi cấy: Tiêu chuẩn vàng nhưng tốn thời gian và không phù hợp để đưa ra quyết định nhanh chóng

Thực tiễn tốt nhất

  • Kiểm dịch dòng tế bào mới cho đến khi được xóa
  • Duy trì hồ sơ chi tiết của tất cả các kết quả thử nghiệm
  • Thực hiện quy trình vận hành tiêu chuẩn để ứng phó với ô nhiễm
  • Tránh sử dụng kháng sinh trong thời gian dài để che giấu sự ô nhiễm

Kiểm tra mycoplasma chủ động, theo lịch trình và thường xuyên thực hành khử nhiễm mycoplasma là một khoản đầu tư thời gian nhỏ có thể tiết kiệm được nhiều tháng làm việc vất vả.

Hình ảnh trang trí có chữ: Phạm vi pH của môi trường nuôi cấy

6. Phạm vi pH của môi trường nuôi cấy

pH của môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong việc ảnh hưởng khả năng sống của tế bào, sự trao đổi chất, hoạt động của enzimkhả năng tái tạo thử nghiệm tổng thể. Bất kỳ độ lệch nào so với phạm vi pH tối ưu đều có thể dẫn đến hành vi tế bào thay đổi, dữ liệu không đáng tin cậy hoặc thậm chí là thất bại hoàn toàn trong nuôi cấy. Duy trì độ pH ổn định đặc biệt quan trọng đối với các loại tế bào nhạy cảm, chẳng hạn như tế bào sơ cấp và tế bào gốc.

Phạm vi pH tối ưu cho tế bào động vật có vú thường nằm trong khoảng 7.2 - 7.4Độ pH dưới 7.2 được coi là có tính axit, trong khi độ pH trên 7.4 được coi là có tính kiềm.

Sự thay đổi pH trong môi trường nuôi cấy tế bào chỉ ra điều gì?

Điều kiện axit – Thường chỉ ra nền văn hóa phát triển quá mức hoặc có thể nhiễm khuẩn. Khi tế bào chuyển hóa chất dinh dưỡng, chúng giải phóng các sản phẩm phụ có tính axit như axit lactic, làm giảm độ pH. Điều này đặc biệt phổ biến trong các nền nuôi cấy dày đặc hoặc khi môi trường ít thay đổi.

Điều kiện kiềm – Có thể phát sinh từ CO2 không đủ niveaux trong lồng ấp hoặc tiếp xúc lâu dài của đĩa nuôi cấy với không khí. Nó cũng có thể xảy ra khi các tế bào không hoạt động trao đổi chất, chẳng hạn như sau khi tế bào chết hoặc trong giai đoạn đầu sau khi rã đông.

Cơ chế điều chỉnh pH

1. Chỉ thị Phenol đỏ

Phenol đỏ, một chất chỉ thị pH phổ biến trong môi trường nuôi cấy tế bào, chuyển từ màu hồng (trung tính) sang màu cam hoặc vàng (có tính axit), tạo ra gợi ý trực quan để theo dõi tình trạng môi trường nuôi cấy theo thời gian thực. Màu vàng của môi trường báo hiệu độ axit tăng và thường chỉ ra nhu cầu thay đổi môi trường nuôi cấy, bất kể thời gian cho ăn theo lịch trình.

Hình 3: Môi trường nuôi cấy tế bào thường được bổ sung phenol đỏ làm chất chỉ thị pH. Màu sắc của môi trường phản ánh mức độ pH—Hồng chỉ ra độ pH trung tính, màu vàng báo hiệu tình trạng axit và màu tím gợi ý môi trường kiềm.
Tham khảo: Bộ sưu tập văn hóa
Phenol đỏ có ảnh hưởng đến tế bào không?

Trong hầu hết các trường hợp, phenol đỏ vô hại và hữu ích để duy trì các nền văn hóa lành mạnh. Tuy nhiên, một số dòng tế bào nhạy cảm hoặc thiết lập thử nghiệm có thể yêu cầu môi trường không chứa phenol đỏ. Điều này là do phenol đỏ thể hiện hoạt động giống estrogen yếu có thể ảnh hưởng đến các tế bào phản ứng với hormone hoặc can thiệp vào các xét nghiệm nhạy cảm với các hợp chất estrogen. Nó cũng có thể gây ra các tín hiệu nền trong các kỹ thuật như đo lưu lượng tế bào hoặc xét nghiệm dựa trên huỳnh quang. Đối với những tình huống này, các công thức không chứa phenol đỏ được ưa chuộng hơn.

2. Hệ thống đệm Natri Bicarbonate–CO₂

Natri bicarbonate (NaHCO₃) là một chất đệm tự nhiên, không độc hại thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy tế bào. Nó đòi hỏi 5% Máy ấp CO₂ để đệm, vì CO₂ hòa tan trong môi trường, tạo thành axit cacbonic, tương tác với các ion bicarbonate để ổn định pH.

Lượng NaHCO₃ trong môi trường quyết định lượng CO₂ cần sử dụng để duy trì độ pH. Độ pH sinh lý thường được coi là trong khoảng từ 7.2 đến 7.4 đối với các mô bình thường, nhưng một số trạng thái bệnh (như ung thư) có thể yêu cầu nuôi cấy ở độ pH thấp hơn. Môi trường thiết yếu tối thiểu của Eagle (EMEM) bổ sung dung dịch muối cân bằng Earle (EBSS) và hầu hết các môi trường nuôi cấy tế bào khác thường chứa 26 mM natri bicarbonate, trong khi DMEM có nồng độ cao hơn là 44 mM.

3. Đệm HEPES – Để ổn định pH bên ngoài máy ấp CO₂

HEPES (axit ethanesulfonic 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine) là một đệm hữu cơ lưỡng tính được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy tế bào để duy trì độ pH ổn định, đặc biệt là trong môi trường mà nồng độ CO₂ có thể dao động. HEPES đặc biệt hiệu quả trong Phạm vi pH từ 6.8 đến 8.2, làm cho nó phù hợp với nhiều dòng tế bào động vật có vú.

Tại sao nên sử dụng HEPES?

  • Khả năng đệm mạnh mẽ: HEPES có khả năng kiểm soát pH ổn định hơn natri bicarbonate, đặc biệt là trong môi trường có nồng độ CO₂ không ổn định.
  • CO- Bộ đệm độc lập: Không giống như bicarbonate, HEPES không cần CO₂ để hoạt động, do đó rất lý tưởng cho các thí nghiệm được thực hiện bên ngoài lồng ấp tiêu chuẩn (ví dụ: hình ảnh trực tiếp, đo lưu lượng tế bào và xét nghiệm sinh học phân tử).
  • Độ trôi pH tối thiểu: HEPES giúp ngăn ngừa sự thay đổi pH nhanh chóng khi tế bào tiếp xúc với không khí xung quanh, cải thiện tính đồng nhất trong quá trình xử lý bên ngoài tủ ấm.

Biowest Basal Media – Công thức linh hoạt cho mọi nhu cầu nuôi cấy tế bào

Tây sinh học cung cấp nhiều công thức môi trường cơ bản phù hợp với nhu cầu đa dạng của các nhà nghiên cứu làm việc với nhiều loại tế bào và điều kiện thử nghiệm khác nhau. Cho dù nuôi cấy các dòng tế bào bất tử mạnh mẽ, tế bào sơ cấp nhạy cảm hay tế bào gốc, Biowest đều cung cấp phương tiện truyền thông sẵn sàng sử dụng có hoặc không có HEPES và natri bicarbonate để hỗ trợ kiểm soát pH và đệm tối ưu.

Các tùy chọn tiêu chuẩn bao gồm:

  • Với Natri Bicarbonate: Thích hợp để sử dụng trong tủ ấm CO₂ 5%, hỗ trợ hệ thống đệm bicarbonate cổ điển.
  • Với đệm HEPES: Đối với các thí nghiệm yêu cầu độ pH ổn định bên ngoài tủ ấm CO₂, chẳng hạn như chụp ảnh trực tiếp, đo lưu lượng tế bào hoặc lấy mẫu tại hiện trường.
  • Không có HEPES/Bicarbonate: Cung cấp tính linh hoạt để tùy chỉnh hệ thống đệm dựa trên nhu cầu thử nghiệm cụ thể.
Một hình ảnh trang trí có văn bản: mức độ nội độc tố

7. Mức độ nội độc tố

Nội độc tố, còn được gọi là lipopolysaccharides (LPS), là thành phần của màng ngoài của vi khuẩn Gram âm. Các phân tử này có thể được giải phóng với số lượng nhỏ trong quá trình phát triển của vi khuẩn và với số lượng lớn hơn khi vi khuẩn bị phân hủy. Ngay cả mức độ vết của nội độc tố cũng có thể gây hại cho sức khỏe của các tế bào nuôi cấy, đặc biệt là trong các ứng dụng nhạy cảm như mở rộng tế bào gốc, phát triển liệu pháp miễn dịch, sản xuất sinh học hoặc mô hình hóa các bệnh viêm. Tác động của chúng thường rất tinh tế nhưng có thể dẫn đến kết quả thử nghiệm không ổn định, không thể tái tạo hoặc gây hiểu lầm.

Nội độc tố ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy tế bào như thế nào

Ngay cả ở nồng độ thấp, nội độc tố vẫn có thể:

  • Kích thích tiết cytokine và chemokine (đặc biệt là trong các tế bào liên quan đến miễn dịch)
  • Kích hoạt các con đường truyền tín hiệu viêm và stress oxy hóa
  • Làm gián đoạn sự tăng sinh, biệt hóa và hình thái tế bào bình thường
  • Làm suy yếu biểu hiện protein trong các hệ thống tái tổ hợp
  • Giảm khả năng sống của tế bào or gây ra apoptosis—đặc biệt là trong nuôi cấy tế bào gốc hoặc tế bào sơ cấp

Các loại tế bào đặc biệt dễ bị nhiễm độc tố nội sinh bao gồm:

  • Tế bào miễn dịch: đại thực bào, tế bào dendrit, PBMC
  • Tế bào gốc: MSC, ESC, iPSC
  • Các tế bào được sử dụng trong quá trình chuyển gen, sản xuất vectơ virus hoặc sản xuất protein điều trị

Các nguồn phổ biến của ô nhiễm nội độc tố

Nội độc tố có thể xâm nhập vào hệ thống nuôi cấy của bạn qua nhiều con đường khác nhau:

  • Nước được sử dụng để chuẩn bị đệm hoặc thuốc thử
  • Nguồn thương mại phương tiện truyền thông, huyết thanh và chất bổ sung
  • Đồ thí nghiệm bị nhiễm bẩn (thủy tinh hoặc nhựa)
  • Tiệt trùng không đúng cách hoặc bình nuôi cấy tái sử dụng
  • Tiếp xúc với không khí hoặc kỹ thuật vô trùng kém

Các bước để tránh các vấn đề nuôi cấy tế bào do nội độc tố gây ra

Sử dụng nước không chứa nội độc tố hoặc nước siêu tinh khiết – Nước dùng để pha dung dịch đệm, rửa đồ thủy tinh hoặc pha loãng môi trường phải có độ tinh khiết cao (ví dụ: nước siêu tinh khiết loại I) và được chứng nhận không chứa nội độc tố.

Chọn FBS cao cấp, ít độc tố – FBS là nguồn nội độc tố phổ biến. Chọn các lô được nhà cung cấp chứng nhận có mức nội độc tố thấp—lý tưởng nhất là dưới 10 EU/mL cho công việc chung và <1 EU/mL cho các ứng dụng nhạy cảm. Biowest FBS được LAL kiểm tra và cung cấp chứng chỉ theo từng lô.

Xác nhận thử nghiệm nội độc tố của môi trường và phụ gia – Đảm bảo môi trường cơ bản, chất bổ sung (ví dụ: yếu tố tăng trưởng, kháng sinh) và chất đệm được sản xuất theo quy trình kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt và được thử nghiệm về nhiễm độc tố nội sinh.

Thực hiện đúng quy trình hấp tiệt trùng cho đồ thủy tinh – Các nội độc tố còn sót lại có tính bền nhiệt, do đó phải đảm bảo rằng đồ thủy tinh không chỉ được khử trùng mà còn được khử chất gây sốt khi cần thiết—thường là khử trùng bằng nhiệt khô ở nhiệt độ ≥250°C trong 30 phút.

Sử dụng đồ nhựa không chứa nội độc tố đã được chứng nhận – Chọn đồ nhựa dùng một lần (ví dụ: đầu pipet, ống, bình) được nhà sản xuất chứng nhận là không chứa nội độc tố. Tránh tái sử dụng hoặc rửa đồ dùng thí nghiệm có thể đã tiếp xúc với chất gây ô nhiễm môi trường.

Giảm thiểu tiếp xúc với các chất gây ô nhiễm môi trường – Làm việc nhanh chóng trong môi trường vô trùng. Chỉ mở bình nuôi cấy dưới tủ hút khí tầng và giảm thời gian xử lý bên ngoài tủ ấm để giảm thiểu nguy cơ tiếp xúc với nội độc tố trong môi trường.

Đảm bảo chất lượng Biowest

Sinh họct cung cấp FBS và môi trường cơ bản được LAL kiểm tra và cung cấp giấy chứng nhận phân tích theo lô cụ thể đối với mức độ nội độc tố, đảm bảo tính nhất quán và độ tin cậy qua các thí nghiệm. Quy trình kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt của họ hỗ trợ các kết quả có thể tái tạo, hiệu suất cao—ngay cả trong các ứng dụng nhạy cảm nhất.

của Biowest FBS nội độc tố cực thấp được thiết kế đặc biệt để đáp ứng các yêu cầu khắt khe của các hệ thống nuôi cấy tế bào nhạy cảm. Mỗi lô được pha chế cẩn thận và thử nghiệm kỹ lưỡng để tuân thủ các ngưỡng nội độc tố nghiêm ngặt, khiến đây trở thành lựa chọn lý tưởng để nuôi cấy tế bào sơ cấp, tế bào gốc và tế bào dành cho các ứng dụng lâm sàng hoặc dược phẩm sinh học. Với Biowest, bạn có thể tự tin rằng các tế bào của mình đang phát triển trong môi trường hỗ trợ cả khả năng tồn tại và tính toàn vẹn.

Kết luận

Nuôi cấy tế bào là một khoa học về số lượng cũng như về kỹ thuật. Nắm vững các thông số định lượng quan trọng—như số lượng đoạn văn, mật độ gieo hạt và sự hợp lưu—có thể có nghĩa là sự khác biệt giữa kết quả có thể tái tạo và thất bại trong thử nghiệm. Cũng quan trọng không kém là các số liệu ít thấy nhưng quan trọng như khả năng sống, tần suất xét nghiệm mycoplasma, độ pH của môi trường nuôi cấy và mức độ nội độc tố. Cùng nhau, bảy con số này tạo thành nền tảng của một hệ thống nuôi cấy tế bào mạnh mẽ, đáng tin cậy. Bằng cách luôn cảnh giác và cập nhật về các giá trị này, các nhà nghiên cứu có thể cải thiện tính nhất quán, bảo vệ sức khỏe tế bào và đảm bảo kết quả có ý nghĩa—cho dù làm việc với các dòng tế bào tiêu chuẩn hay thúc đẩy các ứng dụng lâm sàng nhạy cảm.

Khuyến mãi đặc biệt: Atlantis Bioscience x Biowest – Mua 10 tặng 1 MIỄN PHÍ!

Đừng bỏ lỡ điều này khuyến mãi độc quyền từ Atlantis Bioscience và Biowest! Trong thời gian có hạn, khi bạn mua bất kỳ 10 chai môi trường nuôi cấy tế bào hoặc thuốc thử cao cấp nào của Biowest, bạn sẽ nhận được chai thứ 11 tự do—tự động áp dụng cho mặt hàng có giá trị thấp nhất trong đơn hàng của bạn. Đây là cơ hội hoàn hảo để tích trữ các mặt hàng thiết yếu chất lượng cao cho nghiên cứu của bạn trong khi tiết kiệm nhiều hơn.

để nhận chai miễn phí ngay bây giờ.


Tài liệu tham khảo

Bio, C. (2024, ngày 19 tháng XNUMX). Hiểu về pH và độ thẩm thấu trong môi trường nuôi cấy tế bào. Tiểu sử hấp dẫn. https://captivatebio.com/understanding-ph-osmolality-cell-culture-media/

Nuôi cấy tế bào: Kỹ thuật, loại và theo dõi sự tăng trưởng | Danaher Life Sciences. (nd). Khoa học sự sống Danaher. https://lifesciences.danaher.com/us/en/library/cell-culture.html#:~:text=The%20optimal%20CO2%20level%20for,can%20be%20toxic%20to%20cells.

Xét nghiệm khả năng sống của tế bào | Abcam. (nd). https://www.abcam.com/en-us/technical-resources/guides/cell-health-guide/cell-viability-assays#:~:text=Briefly%2C%20cell%20viability%20is%20the,get%20washed%20away%20during%20trypsinizing.

Nồng độ CO2 và kiểm soát pH trong phòng thí nghiệm nuôi cấy tế bào. (nd). Bộ sưu tập văn hóa. https://www.culturecollections.org.uk/culture-collection-news/co2-concentration-and-ph-control-in-the-cell-culture-laboratory/

Duy trì tế bào | ATCC. (nd). https://www.atcc.org/the-science/culturing-cells/maintaining-cells

Văn phòng, S. (2025, ngày 25 tháng XNUMX). Yêu cầu của CMC đối với liệu pháp tế bào và gen cho các ứng dụng IND | BioAgilytix. BioAgilytix. https://www.bioagilytix.com/blog/cmc-requirements-for-cell-and-gene-therapy-for-ind-applications/

Tỷ lệ tế bào sống. (thứ). ScienceDirect. https://www.sciencedirect.com/topics/immunology-and-microbiology/percentage-of-viable-cells

LIÊN HỆ

BẠN CÓ CÂU HỎI NÀO?

Kết nối với chuyên gia kỹ thuật của chúng tôi.

ĐỪNG BỎ LỠ CÁC TIN TỨC CẬP NHẬT CỦA CHÚNG TÔI.
Theo chúng tôi về MEDIA XÃ HỘI!

CÁC BLOG KHÁC BẠN CÓ THỂ THÍCH

LÀM THẾ NÀO CHÚNG TÔI CÓ THỂ GIÚP BẠN? Các chuyên gia của chúng tôi sẽ giúp bạn tìm sản phẩm tốt nhất cho ứng dụng của bạn. Chúng tôi sẽ rất vui lòng giúp bạn tìm sản phẩm phù hợp cho công việc.

NÓI CHUYỆN VỚI CHUYÊN GIA

Liên hệ với bộ phận Chăm sóc khách hàng, Bán hàng và Hỗ trợ khoa học của chúng tôi

GỬI EMAIL CHO CHÚNG TÔI

Tư vấn và đặt câu hỏi về sản phẩm & dịch vụ của chúng tôi

TÀI LIỆU

Tài liệu về Bảng dữ liệu kỹ thuật và an toàn, Hướng dẫn và nhiều thông tin khác...