สรุป

การควบคุมคุณภาพในวัฒนธรรม MSC ถือเป็นรากฐานสำคัญของการวิจัยโรคมะเร็งที่ประสบความสำเร็จ โดยเน้นย้ำถึงความจำเป็นในการใช้มาตรฐานและระเบียบการที่เข้มงวดเพื่อรักษาความบริสุทธิ์ ความมีชีวิต และฟังก์ชันการทำงาน ด้วยการใช้มาตรการควบคุมคุณภาพที่ครอบคลุม นักวิจัยสามารถรับประกันความน่าเชื่อถือ การทำซ้ำ และศักยภาพในการแปลของการรักษาและการแทรกแซงทางเนื้องอกวิทยาที่ใช้ MSC ในขณะที่ความก้าวหน้าในการวิจัยโรคมะเร็งยังคงมีการพัฒนาอย่างต่อเนื่อง การจัดลำดับความสำคัญของการควบคุมคุณภาพในการเพาะเลี้ยง MSC ยังคงเป็นสิ่งสำคัญยิ่งในการปลดล็อกศักยภาพในการรักษาอย่างเต็มที่ของเซลล์ที่น่าทึ่งเหล่านี้ในการต่อสู้กับมะเร็ง

---

เซลล์ต้นกำเนิดมีเซนไคมัล (MSCs) ซึ่งค้นพบครั้งแรกโดยฟรีเดนสไตน์และเพื่อนร่วมงานในปี 1966 ได้ก้าวข้ามการจดจำในไขกระดูกตั้งแต่แรกเริ่มจนกลายเป็นผู้เล่นหลักในการวิจัยและบำบัดโรคมะเร็ง เซลล์ต้นกำเนิดจากร่างกายที่มีศักยภาพหลายขั้วคล้ายไฟโบรบลาสต์เหล่านี้ ได้มาจากเนื้อเยื่อหลากหลาย รวมถึงไขกระดูก เนื้อเยื่อไขมัน สายสะดือ และเยื่อฟัน แสดงความสามารถพิเศษ เช่น การต่ออายุตัวเองและการสร้างความแตกต่างในเชื้อสายของเซลล์ต่างๆ เนื่องจากสนามมีความก้าวหน้า สมาคมระหว่างประเทศเพื่อการบำบัดเซลล์ (ISCT) ได้กำหนดเกณฑ์ขั้นต่ำสำหรับการกำหนด MSC โดยเน้นคุณลักษณะการทำงานและการแสดงออกของเครื่องหมายบนพื้นผิว โดยเฉพาะอย่างยิ่งในบริบทของการศึกษามะเร็งที่คุณสมบัติในการกำหนดเป้าหมายของเนื้องอกและการปรับภูมิคุ้มกันถือเป็นคำมั่นสัญญาที่สำคัญ

การกำหนด MSC: เกณฑ์ ISCT

จากข้อมูลของ ISCT นั้น MSC มีลักษณะเฉพาะคือ สามเกณฑ์หลัก:

1. การยึดมั่นในพลาสติก:
   • MSC ต้องยึดติดกับพื้นผิวพลาสติกภายใต้สภาวะการเพาะเลี้ยงเซลล์มาตรฐาน
2. ความสามารถหลากหลาย:
   • พวกเขาควรแสดงให้เห็นถึงความสามารถในการแยกความแตกต่างเป็นเซลล์สร้างกระดูก, เซลล์ไขมันและคอนโดรบลาสต์ ในหลอดทดลอง.
3. การแสดงออกของแอนติเจนที่พื้นผิว:
   • MSC ต้องแสดงออกแอนติเจนที่พื้นผิวจำเพาะ เช่น CD73, CD90 และ CD105 ในขณะที่ขาดการแสดงออกของเครื่องหมายจำเพาะเชื้อสายซึ่งรวมถึง CD11b/CD14, CD19/CD79α, CD34, CD45 และ HLA-DR

การควบคุมคุณภาพวัฒนธรรม MSC ความท้าทายและการพิจารณา

ความแตกต่างและความแปรปรวน

อุปสรรคสำคัญประการหนึ่งที่ขัดขวางการยอมรับการรักษาโดยใช้ MSC ในวงกว้างคือความแตกต่างโดยธรรมชาติของเซลล์ที่แยกได้ มีการสังเกตความแปรผันของศักยภาพในการเติบโต ความสามารถในการสร้างความแตกต่าง และโปรไฟล์การแสดงออกของโปรตีนในแหล่งที่มาของเนื้อเยื่อและกระบวนการผลิตที่แตกต่างกัน ความแตกต่างนี้ไม่เพียงแต่ทำให้การกำหนดมาตรฐานของผลิตภัณฑ์ที่ใช้ MSC มีความซับซ้อนเท่านั้น แต่ยังส่งผลต่อประสิทธิภาพการรักษาและโปรไฟล์ด้านความปลอดภัยอีกด้วย

การแยกตัวและการขยายวัฒนธรรมของ MSCs

ขั้นตอนทางคลินิกใช้วิธีการเพาะเลี้ยงเซลล์เพื่อขยาย MSC หลักที่ได้รับจากแหล่งเนื้อเยื่อเฉพาะในประชากรจำนวนจำกัด โดยขยายออกไปผ่านหลายตอนเพื่อให้มีจำนวนเซลล์ที่มีนัยสำคัญทางคลินิก การไม่มีโปรโตคอลที่เป็นที่ยอมรับในระดับสากลสำหรับการแยกและการขยาย MSC ส่งผลให้เกิดความแปรปรวนอย่างมาก ในหลอดทดลอง เทคนิควัฒนธรรมในหน่วยงานวิจัย ความแปรปรวนนี้ทำให้การเปรียบเทียบผลการวิจัยในการศึกษาต่างๆ มีความซับซ้อน

กลยุทธ์การขยายตัวที่มีประสิทธิผลมุ่งมั่นที่จะเพิ่มจำนวนเซลล์อย่างมีนัยสำคัญ ขณะเดียวกันก็รักษาศักยภาพในการรักษาของ MSCs โดยเฉพาะอย่างยิ่ง MSC แสดงอัตราการแพร่กระจายที่ลดลงเมื่อเวลาผ่านไปและด้วยข้อความที่ต่อเนื่องกัน ในที่สุดก็ถึงสภาวะชราภาพโดยหยุดการเติบโต นอกจากนี้ ระยะเวลาการเพาะเลี้ยงที่ยืดเยื้ออาจส่งผลต่อความสามารถในการสร้างความแตกต่างของเซลล์

ดังนั้น การจัดทำเกณฑ์วิธีที่เป็นมาตรฐาน การเพิ่มประสิทธิภาพของเงื่อนไขการเพาะเลี้ยง และการนำมาตรการควบคุมคุณภาพที่เข้มงวดไปใช้จึงมีความจำเป็นในการรักษาคุณลักษณะและฟังก์ชันการทำงานของ MSC ที่สอดคล้องกันในชุดงานต่างๆ

วัฒนธรรมเอ็มเอสซี พารามิเตอร์การควบคุมคุณภาพที่สำคัญ

การแสดงออกของแอนติเจนบนผิวเซลล์ (เครื่องหมายซีดี)

ISCT เสนอชุดเครื่องหมายบวกและลบที่ช่วยให้นักวิจัยสามารถแยกแยะ MSC จากเซลล์อื่นๆ ในช่องไขกระดูกได้ เครื่องหมายลบถูกเลือกเพื่อรวมแอนติเจนที่พื้นผิวที่แสดงโดยเซลล์เม็ดเลือด ในขณะที่เครื่องหมายเชิงบวกถูกเลือกเนื่องจากไม่มีอยู่ในเซลล์เม็ดเลือดส่วนใหญ่

นับตั้งแต่มีการตีพิมพ์เครื่องหมายที่ ISCT เสนอในปี พ.ศ. 2006 เครื่องหมายเพิ่มเติมหลายตัวได้รับการยอมรับอย่างกว้างขวางว่าเป็นเครื่องหมาย MSC แผงขยายของเครื่องหมายที่เกี่ยวข้องกับ MSC ช่วยให้นักวิจัยสามารถตรวจสอบการแสดงออกของแอนติเจนบนพื้นผิวที่เกี่ยวข้องกับ MSC หลายตัวพร้อมกัน จึงเพิ่มความมั่นใจในการระบุและการตรวจสอบ MSC ที่แยกออกมา เครื่องหมาย MSC ที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย ได้แก่ CD29, CD44, CD146, CD166, CD271 และ STRO-1

โดยทั่วไปการวิเคราะห์การแสดงออกของมาร์กเกอร์จะดำเนินการโดยใช้โฟลว์ไซโตเมทรี ซึ่งสามารถเปิดเผยฟีโนไทป์ของแต่ละเซลล์ได้ Multi Colour Flow Cytometry ช่วยให้ผู้ใช้สามารถตรวจสอบมาร์กเกอร์หลายตัวได้พร้อมๆ กัน นอกจากนี้ โฟลว์ไซโตมิเตอร์จำนวนมากยังมีฟังก์ชันการเรียงลำดับเซลล์ที่สามารถใช้เพื่อเพิ่มจำนวนประชากร MSC ที่เฉพาะเจาะจง และกำจัดเซลล์ที่ตายแล้วออกจากการวิเคราะห์

ความมีชีวิตและการแพร่กระจายของเซลล์

ความมีชีวิตของ MSC ที่เก็บเกี่ยวสามารถประเมินได้โดยใช้การย้อมสีทริแพนบลูหรือ 7-อะมิโน-แอกติโนมัยซิน D (7-อ๊าด) วิธีการยกเว้น เพื่อให้บรรลุผลลัพธ์ทางคลินิกที่เหมาะสมที่สุดด้วยการใช้ MSCs ทันที และเพื่อให้มั่นใจว่าสามารถมีชีวิตที่ยอมรับได้หลังการเก็บรักษาด้วยความเย็นจัด ความมีชีวิตหลักควรเกิน 90%

การทดสอบหน่วยการขึ้นรูปโคโลนี (CFU) ทำหน้าที่เป็นวิธีการที่ได้รับการยอมรับอย่างกว้างขวางในการประเมินความสามารถในการต่ออายุตนเองของ MSC การทดสอบนี้วัดปริมาณประสิทธิภาพที่ MSC สร้างหน่วยโคโลนีเมื่อเพาะที่ความหนาแน่นของโคลนเจนิกในการเพาะเลี้ยงแบบชั้นเดียวบนพลาสติกเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ โดยปกติ สารแขวนลอยเซลล์เดียวของ MSC จะต้องเจือจางแบบอนุกรมก่อนที่จะนำไปชุบบนจานเพาะเลี้ยง เมื่อมองเห็นได้ โดยทั่วไปประมาณวันที่ 8 หรือ 10 อาณานิคมจะถูกย้อมด้วย Giemsa และนับต่อมา ในปัจจุบัน การสอบวิเคราะห์ CFU-F ถูกนำมาใช้ ในหลอดทดลอง เพื่อประเมินคุณภาพของการเตรียม MSC ที่มีไว้สำหรับการวิจัยพรีคลินิกและการทดลองทางคลินิก

ศักยภาพในการสร้างความแตกต่างแบบ Tri-Lineage

MSC มีลักษณะเฉพาะด้วยความสามารถอันน่าทึ่งในการแยกความแตกต่างออกเป็นสามเชื้อสายที่แตกต่างกัน: adipocytes, chondrocytes และ Osteocytes เมื่อเพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะเฉพาะ การตรวจสอบความแตกต่างที่ประสบความสำเร็จสามารถตรวจสอบได้โดยการย้อมเซลล์ที่แตกต่างเพื่อการแสดงออกของเครื่องหมายเชื้อสายและ/หรือโดยการประเมินการทำงานของเซลล์ การยืนยันความแตกต่างของเชื้อสายสามสายเป็นหลักฐานที่ดีเยี่ยมสำหรับการตรวจสอบยืนยันตัวตนของ MSC

1. ความแตกต่างของกระดูก:
   • MSC สามารถมุ่งไปสู่การสร้างความแตกต่างในเซลล์สร้างกระดูก ซึ่งเป็นเซลล์พิเศษที่รับผิดชอบในการสร้างกระดูกและการสร้างแร่ธาตุ กระบวนการสร้างความแตกต่างของกระดูกเกี่ยวข้องกับการผลิตเมทริกซ์นอกเซลล์ที่มีแร่ธาตุโดยเซลล์สร้างกระดูก เพื่อประเมินการสร้างความแตกต่างของกระดูก นักวิจัยมักจะวัดการทำงานของเครื่องหมายเฉพาะ เช่น อัลคาไลน์ฟอสฟาเตส (ALP) หรือใช้เทคนิคการย้อมสีเช่น Alizarin Red S เพื่อแสดงภาพการสะสมของแคลเซียม ซึ่งบ่งชี้ถึงการสร้างกระดูกที่สมบูรณ์
2. ความแตกต่าง Adipogenic:
   • เมื่ออยู่ภายใต้สภาวะการเหนี่ยวนำให้เกิด adipogenic MSC สามารถแยกความแตกต่างออกเป็น adipocytes ซึ่งเป็นเซลล์ที่เชี่ยวชาญในการเก็บไขมัน กระบวนการสร้างความแตกต่าง adipogenic ส่งผลให้เกิดการสะสมของหยดไขมันภายในเซลล์ที่แตกต่าง เพื่อยืนยันความแตกต่างของ adipogenic จึงมักใช้การย้อมสี Oil Red O ซึ่งช่วยให้มองเห็นการสะสมของไขมันและยืนยันฟีโนไทป์ของ adipocyte
3. ความแตกต่างของกระดูกอ่อน:
   • MSC มีความสามารถในการแยกความแตกต่างออกเป็น chondrocytes ซึ่งเป็นเซลล์ปฐมภูมิที่พบในเนื้อเยื่อกระดูกอ่อนที่รับผิดชอบในการผลิตส่วนประกอบเมทริกซ์นอกเซลล์ที่จำเพาะต่อกระดูกอ่อน การสร้างความแตกต่างของกระดูกอ่อนเป็นสิ่งสำคัญสำหรับการซ่อมแซมกระดูกอ่อนและการฟื้นฟู รอยเปื้อนทางจุลพยาธิวิทยา เช่น Alcian Blue มักถูกใช้เพื่อตรวจจับการมีอยู่ของ glycosaminoglycans เพื่อยืนยันการก่อตัวของเนื้อเยื่อกระดูกอ่อน และตรวจสอบความถูกต้องของศักยภาพในการสร้างความแตกต่างของกระดูกอ่อนของ MSC

การตรวจวิเคราะห์เชิงหน้าที่เพื่อประเมินศักยภาพของ MSC และศักยภาพในการรักษา

ในขณะที่ ในหลอดทดลอง การแยก MSCs ออกเป็นเชื้อสายที่สร้างกระดูก, กระดูกอ่อน และ adipogenic ทำหน้าที่เป็นลักษณะพื้นฐาน การพัฒนาทางคลินิกของการรักษาโดยใช้ MSC จำเป็นต้องมีการสร้างการทดสอบศักยภาพ การตรวจวิเคราะห์เหล่านี้มีจุดมุ่งหมายเพื่อประเมินคุณลักษณะการทำงานทางชีวภาพจำเพาะที่สอดคล้องกับกลไกการออกฤทธิ์ทางคลินิกที่คาดการณ์ไว้ของ MSC ด้านล่างนี้คือชุดทดสอบการทำงานที่สำคัญหลายประการที่ใช้ในการประเมินประสิทธิภาพของ MSC และประสิทธิภาพในการรักษา:

1. การตรวจภูมิคุ้มกัน:
   • การทำความเข้าใจคุณสมบัติการปรับภูมิคุ้มกันของ MSCs เป็นสิ่งสำคัญ เนื่องจากสามารถนำไปใช้ในความผิดปกติเกี่ยวกับระบบภูมิคุ้มกันและการปลูกถ่ายได้ การตรวจวิเคราะห์การเพาะเลี้ยงร่วมที่เกี่ยวข้องกับเซลล์ภูมิคุ้มกัน เช่น ทีเซลล์ ให้ข้อมูลเชิงลึกที่มีคุณค่าเกี่ยวกับผลกดภูมิคุ้มกันของ MSC ช่วยให้นักวิจัยสามารถประเมินความสามารถในการปรับการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันได้อย่างมีประสิทธิภาพ
2. การตรวจการย้ายถิ่นและการกลับบ้าน:
   • MSC มีความสามารถในการย้ายถิ่นโดยธรรมชาติ ทำให้พวกมันสามารถกลับบ้านไปยังบริเวณที่เกิดการบาดเจ็บของเนื้อเยื่อเฉพาะจุดหรือสภาพแวดล้อมจุลภาคที่มีการอักเสบได้ การตรวจการย้ายถิ่นของ Transwell หรือการตรวจการรักษาบาดแผลนำเสนอแพลตฟอร์มที่มีประสิทธิภาพสำหรับการประเมินการย้ายถิ่นของ MSC เพื่อตอบสนองต่อเคมีบำบัดหรือสิ่งเร้าต่างๆ ดังนั้นจึงช่วยอธิบายศักยภาพในการกลับบ้านและประสิทธิภาพในการกำหนดเป้าหมายเนื้อเยื่อ
3. การตรวจวิเคราะห์การสร้างหลอดเลือด:
   • คุณสมบัติในการกระตุ้นการสร้างหลอดเลือดของ MSCs ถือเป็นคำมั่นสัญญาที่สำคัญในการเสริมสร้างกระบวนการสร้างและซ่อมแซมเนื้อเยื่อ การทดสอบการก่อตัวของหลอดทดลองในหลอดทดลอง ซึ่งเกี่ยวข้องกับการเพาะเลี้ยง MSC ร่วมกับเซลล์บุผนังหลอดเลือด ถือเป็นแพลตฟอร์มที่แข็งแกร่งสำหรับการประเมินศักยภาพในการสร้างเส้นเลือดใหม่ของ MSC และความสามารถในการกระตุ้นการสร้างหลอดเลือดใหม่ ซึ่งเป็นขั้นตอนสำคัญในการสร้างเนื้อเยื่อใหม่และการรักษาบาดแผล
4. การสอบวิเคราะห์กิจกรรมพาราคริน:
   • MSC ให้ผลการรักษาผ่านการหลั่งของปัจจัยพาราครินต่างๆ รวมถึงปัจจัยการเจริญเติบโต ไซโตไคน์ และถุงนอกเซลล์ การตรวจวิเคราะห์เชิงปริมาณ เช่น การตรวจด้วยเอนไซม์ที่เชื่อมโยงกับอิมมูโนซอร์เบนท์ (ELISA) หรือการตรวจไซโตไคน์แบบมัลติเพล็กซ์ อำนวยความสะดวกในการวิเคราะห์ที่ครอบคลุมของปัจจัยที่หลั่งออกมาจาก MSC โดยให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับกิจกรรมพาราครินและศักยภาพในการรักษา
5. คุณสมบัติทางกล:
   • การศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้ยังได้เริ่มสำรวจคุณสมบัติทางกลของ MSC เช่น ความแข็งและคุณสมบัติยืดหยุ่นหนืด ซึ่งอาจส่งผลต่อพฤติกรรมและการทำงานของพวกมัน ในร่างกาย. เทคนิคขั้นสูง เช่น กล้องจุลทรรศน์แรงอะตอม (AFM) หรือการวิเคราะห์เชิงรีโอโลยีให้ข้อมูลที่มีคุณค่าเกี่ยวกับคุณสมบัติเชิงกลของ MSC ซึ่งมีส่วนช่วยให้เข้าใจลักษณะทางชีววิทยาและการประยุกต์ใช้ในการรักษาได้ครอบคลุมมากขึ้น

---

อ้างอิง

Andrzejewska A, Lukomska B, Janowski M. รีวิวโดยย่อ: เซลล์ต้นกำเนิดจาก Mesenchymal: จากรากสู่การเพิ่มประสิทธิภาพ เซลล์ต้นกำเนิด. 2019;37(7):855-864. ดอย:10.1002/stem.3016

Dominici M, Le Blanc K, Mueller I และคณะ เกณฑ์ขั้นต่ำสำหรับการกำหนดเซลล์สโตรมัลมีเซนไคมัลหลายขั้ว คำแถลงจุดยืนของสมาคมระหว่างประเทศเพื่อการบำบัดด้วยเซลล์ ไซโตบำบัด 2006;8(4):315-317. ดอย:10.1080/14653240600855905

Fonseca LN, Bolívar-Moná S, Agudelo T และคณะ เครื่องหมายบนผิวเซลล์สำหรับเซลล์ต้นกำเนิดมีเซนไคมัลที่เกี่ยวข้องกับระบบโครงกระดูก: การทบทวนการกำหนดขอบเขต เฮลิยอน. 2023;9(2):e13464. เผยแพร่เมื่อ 2023 กุมภาพันธ์ 10. doi:10.1016/j.heliyon.2023.e13464

Zhou T, Yuan Z, Weng J, Pei D, Du X, He C, Lai P. ความท้าทายและความก้าวหน้าในการใช้งานทางคลินิกของเซลล์ stromal mesenchymal เจ ฮีมาทอล ออนคอล 2021 ก.พ. 12;14(1):24. ดอย: 10.1186/s13045-021-01037-x