กล้องจุลทรรศน์เป็นเสมือนดวงตาที่ช่วยให้เรามองเห็นโลกที่มองไม่เห็น เผยให้เห็นรายละเอียดที่ซับซ้อนของสิ่งมีชีวิตและสสาร ตั้งแต่จุลินทรีย์ที่เล็กที่สุดไปจนถึงโครงสร้างที่ซับซ้อนของสสาร กล้องจุลทรรศน์ได้เปิดจักรวาลแห่งความรู้ที่ครั้งหนึ่งเคยอยู่เหนือความเข้าใจของเรา
1 รูป: กำลังแยกของกล้องจุลทรรศน์ด้วยตาเปล่า กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง และกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน
ที่มา: ศูนย์การเรียนรู้วิทยาศาสตร์
การเดินทางสู่กล้องจุลทรรศน์เริ่มต้นในช่วงปลายศตวรรษที่ 16 เมื่อ Zacharias Jansenผู้ผลิตแว่นตาชาวดัตช์ ได้รับการยกย่องว่าเป็นผู้ประดิษฐ์กล้องจุลทรรศน์แบบประกอบตัวแรก สิ่งประดิษฐ์ที่ก้าวล้ำนี้วางรากฐานให้กับเทคนิคต่างๆ มากมายที่มีอยู่ในปัจจุบัน เทคนิคเหล่านี้แตกต่างกันอย่างมากขึ้นอยู่กับประเภทของแสงที่ใช้ วิธีการสร้างภาพ และการใช้งานเฉพาะที่ใช้
ในการสำรวจครั้งนี้ เราจะเจาะลึกเข้าไปในโลกที่น่าสนใจของเทคนิคกล้องจุลทรรศน์ เปิดเผยหลักการพื้นฐาน ความสามารถ และข้อจำกัดของเทคนิคเหล่านี้ โดยการทำความเข้าใจจุดแข็งและจุดอ่อนของแนวทางต่างๆ นักวิจัยสามารถเลือกเทคนิคที่เหมาะสมที่สุดเพื่อไขความลับที่ซ่อนอยู่ในตัวอย่างได้
2 รูป: การตั้งค่าออปติกของกล้องจุลทรรศน์ไบรท์ฟิลด์ (ซ้าย) ภาพไบรท์ฟิลด์ของเซลล์หัวหอมในระยะต่างๆ ของไมโทซิส (ขวา)
แหล่งที่มา: ชมรมกล้องจุลทรรศน์; วิกิพีเดีย
กล้องจุลทรรศน์ไบรท์ฟิลด์เป็นเทคนิคพื้นฐานในกล้องจุลทรรศน์ ซึ่งใช้กันอย่างแพร่หลายเนื่องจากความเรียบง่ายและความน่าเชื่อถือ เนื่องจากเป็นหนึ่งในวิธีการที่พบมากที่สุดในด้านชีววิทยาและการแพทย์ จึงทำให้สามารถสังเกตตัวอย่างต่างๆ ได้อย่างละเอียด
กล้องจุลทรรศน์แบบไบรท์ฟิลด์ใช้ระบบออปติกพื้นฐานที่แสงจะถูกรวบรวมโดยคอนเดนเซอร์ ส่งผ่านตัวอย่างไปยังเลนส์วัตถุ ภาพที่ได้เกิดจากการเปลี่ยนแปลงของความเข้มแสงที่เกิดจากการดูดกลืน การสะท้อน และการหักเหของแสงของตัวอย่าง กลไกคอนทราสต์นี้ทำให้ตัวอย่างมีสีเข้มบนพื้นหลังที่สว่าง จึงเป็นที่มาของชื่อ กล้องจุลทรรศน์แบบไบรท์ฟิลด์มีประสิทธิภาพสูงสุดกับตัวอย่างที่บางและโปร่งแสงซึ่งแสดงคอนทราสต์เพียงพอ คอนทราสต์นี้สามารถมีอยู่ในตัวอย่างได้ เช่น เม็ดสีตามธรรมชาติ หรือเพิ่มความคมชัดด้วยเทคนิคย้อมสี
กล้องจุลทรรศน์แบบไบรท์ฟิลด์มีประโยชน์หลากหลายสาขา นักชีววิทยาและนักวิทยาศาสตร์การแพทย์ใช้เทคนิคนี้ในการตรวจสอบเซลล์ เนื้อเยื่อ และจุลินทรีย์ นักวิทยาศาสตร์ด้านวัสดุยังใช้กล้องจุลทรรศน์แบบไบรท์ฟิลด์เพื่อวิเคราะห์โครงสร้างของวัสดุด้วย
แม้ว่าจะได้ผลกับตัวอย่างที่มีความคมชัดเพียงพอ แต่กล้องจุลทรรศน์แบบไบรท์ฟิลด์ก็ยังมีปัญหากับตัวอย่างที่โปร่งใส ความสามารถของเทคนิคนี้ในการมองเห็นรายละเอียดถูกจำกัดด้วยความคมชัดระหว่างตัวอย่างและพื้นหลัง
3 รูป: การติดตั้งออปติกของกล้องจุลทรรศน์ Darkfield (ซ้าย) ภาพ Darkfield ของ Ceriodaphnia ดูเบีย (ขวา).
แหล่งที่มา: ชมรมกล้องจุลทรรศน์; วิกิพีเดีย
กล้องจุลทรรศน์แบบดาร์กฟิลด์จะสร้างภาพที่สะดุดตาเมื่อเปรียบเทียบกับกล้องจุลทรรศน์แบบไบรท์ฟิลด์ โดยจะปิดกั้นแสงโดยตรงไม่ให้ไปถึงเลนส์วัตถุ มีเพียงแสงที่กระจัดกระจายจากตัวอย่างเท่านั้นที่จะเข้าสู่เลนส์ ส่งผลให้ได้ตัวอย่างที่สว่างบนพื้นหลังสีเข้ม
กล้องจุลทรรศน์แบบ Darkfield ให้ความคมชัดสูงด้วยการปิดกั้นแสงโดยตรงไม่ให้ส่องถึงชิ้นงาน ด้วยคอนเดนเซอร์พิเศษ แสงจะส่องไปที่ชิ้นงานจากด้านข้าง ทำให้เกิดแสงส่องออกมาเป็นทรงกรวยกลวง เมื่อมีชิ้นงานอยู่ แสงจะกระจายออกไป ทำให้แสงส่องเข้าเลนส์วัตถุ ทำให้ได้ภาพของชิ้นงานที่สว่างสดใสบนพื้นหลังสีเข้ม ทำให้มองเห็นได้ชัดเจนขึ้น โดยเฉพาะชิ้นงานที่ไม่ได้ย้อมสีและโปร่งใส
กล้องจุลทรรศน์แบบ Darkfield มีประโยชน์อย่างยิ่งในการสังเกตตัวอย่างที่มีชีวิตที่ยังไม่ได้ย้อมสี เช่น แบคทีเรีย โปรโตซัว และสไปโรคีต นอกจากนี้ยังใช้ในวิทยาศาสตร์วัสดุเพื่อตรวจจับอนุภาคขนาดเล็กและข้อบกพร่องต่างๆ อีกด้วย กล้องจุลทรรศน์แบบ Darkfield มีประสิทธิภาพในการเน้นโครงสร้างพื้นผิว ข้อบกพร่อง และขอบเขตในตัวอย่างที่ทึบแสง
พื้นหลังสีเข้มอาจทำให้มองเห็นรายละเอียดเล็กๆ น้อยๆ ในตัวอย่างได้ยาก ขณะที่ฝุ่นและเศษต่างๆ อาจปรากฏเป็นวัตถุที่มีสีสว่าง ซึ่งอาจบดบังตัวอย่างได้ นอกจากนี้ ความเข้มของแสงสูงที่จำเป็นสำหรับการถ่ายภาพแบบสนามมืดอาจสร้างความเสียหายให้กับตัวอย่างที่บอบบางได้
กล้องจุลทรรศน์แบบคอนทราสต์เฟสเป็นเทคนิคที่มีประสิทธิภาพในการมองเห็นตัวอย่างโปร่งใส เช่น เซลล์ที่มีชีวิต ซึ่งไม่มีคอนทราสต์เพียงพอสำหรับกล้องจุลทรรศน์แบบไบรท์ฟิลด์ เทคนิคนี้ใช้ประโยชน์จากข้อเท็จจริงที่ว่าโครงสร้างต่างๆ ภายในตัวอย่างมีดัชนีการหักเหของแสงที่แตกต่างกัน ทำให้แสงเดินทางผ่านด้วยความเร็วที่แตกต่างกัน
คอนเดนเซอร์พิเศษและเลนส์วัตถุใช้เพื่อแปลงความแตกต่างของเฟส (ที่มองไม่เห็นด้วยตาเปล่า) ให้เป็นความแตกต่างของแอมพลิจูด (มองเห็นได้จากการเปลี่ยนแปลงของความสว่าง) ซึ่งจะช่วยเพิ่มความคมชัดของตัวอย่างโดยไม่ต้องย้อมสี
กล้องจุลทรรศน์แบบคอนทราสต์เฟสใช้กันอย่างแพร่หลายในชีววิทยาเซลล์เพื่อศึกษาเซลล์ที่มีชีวิต สังเกตโครงสร้างภายในเซลล์ และติดตามกระบวนการไดนามิก นอกจากนี้ยังใช้ในจุลชีววิทยาเพื่อตรวจสอบแบคทีเรียและจุลินทรีย์อื่นๆ
ภาพแบบคอนทราสต์เฟสมักแสดงสิ่งแปลกปลอมรอบขอบของโครงสร้าง ซึ่งอาจบดบังรายละเอียดได้ วงแหวนเฟสในเลนส์วัตถุสามารถลดความละเอียดโดยรวมได้เล็กน้อยเมื่อเทียบกับกล้องจุลทรรศน์แบบไบรท์ฟิลด์ นอกจากนี้ยังมีค่าใช้จ่ายที่สูงกว่าเนื่องจากต้องใช้เลนส์วัตถุแบบคอนทราสต์เฟสพิเศษและคอนเดนเซอร์มากกว่าเลนส์ไบรท์ฟิลด์มาตรฐาน
4 รูป: ภาพของเซลล์เกลียของมนุษย์ใน Brightfield (ซ้าย) และ Phase Contrast (ขวา)
แหล่งที่มา: กล้องจุลทรรศน์U
5 รูป: ภาพ DIC (a, c, e) และภาพคอนทราสต์เฟส (b, d, f) ของเซลล์เยื่อบุผิวเยื่อบุผิวในช่องปากของมนุษย์ (a, b) ส่วนหนาของเนื้อเยื่อไตของหนู (c, d) และเนื้อเยื่อหุ้มลำต้นที่มีวงแหวนของโพลีพอยด์โอเบเลีย
แหล่งที่มา: โอลิมปัส ไลฟ์ไซเอนซ์
กล้องจุลทรรศน์แบบคอนทราสต์การรบกวนแบบดิฟเฟอเรนเชียล (DIC) หรือที่เรียกอีกอย่างว่าคอนทราสต์การรบกวนแบบโนมาร์สกี เป็นเทคนิคที่ซับซ้อนซึ่งสร้างภาพที่ชัดเจนและเกือบเหมือนภาพสามมิติของตัวอย่างโปร่งใส เทคนิคนี้โดดเด่นในการแสดงความแตกต่างที่ละเอียดอ่อนในดัชนีการหักเหของแสงภายในตัวอย่าง
DIC ใช้แสงโพลาไรซ์และชุดองค์ประกอบออปติกเพื่อสร้างลำแสงสองลำที่เหลื่อมกันเล็กน้อยซึ่งผ่านตัวอย่าง ความแตกต่างของความยาวเส้นทางแสงระหว่างลำแสงเหล่านี้ ซึ่งเกิดจากการเปลี่ยนแปลงในดัชนีหักเหของตัวอย่าง ส่งผลให้เกิดรูปแบบการรบกวนที่สร้างภาพขึ้นมา
DIC มีประโยชน์อย่างยิ่งสำหรับการศึกษาตัวอย่างทางชีววิทยาที่ไม่ได้ย้อมสี เช่น เซลล์ที่มีชีวิต ตัวอ่อน และจุลินทรีย์ เทคนิคนี้ยังมีประโยชน์ในวิทยาศาสตร์วัสดุสำหรับการตรวจสอบวัสดุโปร่งใสหรือโปร่งแสงอีกด้วย
กล้องจุลทรรศน์ DIC เหมาะที่สุดสำหรับตัวอย่างที่บางและโปร่งใสซึ่งมีการเปลี่ยนแปลงดัชนีหักเหแสงเพียงเล็กน้อย ประสิทธิภาพจะลดลงอย่างมากสำหรับตัวอย่างที่หนากว่า เช่น ส่วนเนื้อเยื่อ หรือตัวอย่างที่มีเม็ดสีเข้มข้น เนื่องจาก DIC ต้องใช้ส่วนประกอบออปติกเฉพาะทาง จึงทำให้ต้นทุนโดยรวมของระบบกล้องจุลทรรศน์เพิ่มขึ้น
กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงแบบสนามกว้างเป็นเทคนิคพื้นฐานที่ส่องแสงไปทั่วตัวอย่างทั้งหมดด้วยแสงเร้าเพื่อให้มองเห็นโครงสร้างที่ติดฉลากด้วยสารเรืองแสงได้
การเรืองแสงเกิดขึ้นเมื่อสารเรืองแสงดูดซับแสงที่ความยาวคลื่นเฉพาะ (การกระตุ้น) และปล่อยแสงที่ความยาวคลื่นที่ยาวกว่า เพื่อแสดงโมเลกุลเป้าหมาย จะใช้โพรบที่จับคู่กับสารเรืองแสง เช่น แอนติบอดีหรือโพรบกรดนิวคลีอิก เพื่อติดฉลากส่วนประกอบที่สนใจโดยเฉพาะ จากนั้นตัวอย่างจะถูกส่องแสงด้วยแสงกระตุ้น และแสงเรืองแสงที่เปล่งออกมาจะถูกเก็บรวบรวมโดยเลนส์วัตถุ ฟิลเตอร์จะส่งผ่านแสงที่เปล่งออกมาอย่างเลือกสรรในขณะที่ปิดกั้นแสงกระตุ้น ทำให้เกิดภาพที่มีโครงสร้างเรืองแสงปรากฏสว่างบนพื้นหลังสีเข้ม
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบสนามกว้างใช้กันอย่างแพร่หลายในการวิจัยทางชีววิทยาสำหรับการย้อมอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์เพื่อตรวจจับและระบุตำแหน่งของโปรตีนเฉพาะ นอกจากนี้ยังใช้ในการผสมพันธุ์แบบอินซิทูเพื่อศึกษารูปแบบการแสดงออกของยีน และการสร้างภาพเซลล์เพื่อแสดงโครงสร้างและพลวัตของเซลล์
กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบสนามแสงกว้างนั้นมีความอเนกประสงค์ แต่ก็มีข้อจำกัดหลายประการ แสงที่เปล่งออกมาจากบริเวณด้านบนและด้านล่างของระนาบโฟกัสจะทำให้เกิดสัญญาณรบกวนในพื้นหลัง ทำให้ภาพมีความชัดเจนและความคมชัดลดลง โดยเฉพาะในตัวอย่างที่มีความหนา การได้รับแสงเร้าเป็นเวลานานอาจสร้างความเสียหายให้กับตัวอย่างที่ไวต่อแสงได้ ความเข้มข้นของฟลูออเรสเซนต์ที่ต่ำอาจส่งผลให้สัญญาณฟลูออเรสเซนต์อ่อนลง
7 รูป: ภาพ 3 มิติของกล้องจุลทรรศน์แบบฟิลด์กว้าง (a, c และ e) และกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคัล (b, d และ f) ของเซลล์เยื่อบุผิวที่ติดฉลากด้วย DAPI (ดีเอ็นเอนิวเคลียร์-สีน้ำเงิน) Alexa 488-ฟัลโลอิดิน (สายพันธุ์ของเส้นใยแอคติน-สีเขียว) และ MitoTracker Red (ไมโตคอนเดรีย-สีแดง) (a, b) ส่วนไตของหนูหนาประมาณ 20 ไมโครเมตร ติดฉลากด้วย DAPI (ดีเอ็นเอนิวเคลียร์-สีน้ำเงิน) Alexa 488-แอกกลูตินินจมูกข้าวสาลี (คราบเมมเบรน-สีเขียว) และ Alexa 568-ฟัลโลอิดิน (คราบเส้นใยแอคติน-สีแดง) (c, d) และการเพาะเลี้ยงเซลล์เยื่อบุผิวเต้านม MCF-3A แบบ 10 มิติที่มีรูปร่างเป็นทรงกลมหนาประมาณ 50 ไมโครเมตร ติดฉลากด้วยฟิวชันโปรตีนเรืองแสงนิวเคลียร์สีเขียวและฟิวชันโปรตีนเรืองแสงสีแดงที่ทำเครื่องหมายเยื่อหุ้มเซลล์ (e, f)
ที่มา: doi: 10.7171/จบ.15-2602-003
กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคัลเป็นเทคนิคที่มีประสิทธิภาพที่เอาชนะข้อจำกัดของกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบสนามกว้างด้วยการปรับปรุงความละเอียดและความคมชัดของภาพอย่างมีนัยสำคัญ
กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคัลใช้เลเซอร์ในการสแกนตัวอย่างทีละจุด รูพรุนจะถูกวางไว้ด้านหน้าตัวตรวจจับ ซึ่งจะทำให้ตรวจจับได้เฉพาะแสงที่ปล่อยออกมาจากระนาบโฟกัสเท่านั้น วิธีนี้จะช่วยขจัดแสงที่อยู่นอกโฟกัสได้อย่างมีประสิทธิภาพ ส่งผลให้ได้ภาพที่คมชัดยิ่งขึ้น
กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคัลใช้เทคนิคต่างๆ เพื่อให้ได้ภาพที่มีความละเอียดสูง:
กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคัลใช้กันอย่างแพร่หลายในงานวิจัยทางชีววิทยาและชีวการแพทย์เพื่อศึกษาโครงสร้างของเซลล์ ตำแหน่งของโปรตีน และกระบวนการไดนามิก มีประโยชน์อย่างยิ่งในการถ่ายภาพตัวอย่างที่มีความหนา เช่น เนื้อเยื่อและตัวอ่อน เนื่องจากสามารถสร้างส่วนออปติกได้
แม้ว่ากล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคัลจะมีข้อได้เปรียบที่สำคัญเหนือกล้องจุลทรรศน์แบบมุมกว้างแบบดั้งเดิม แต่ก็มีข้อจำกัดบางประการเช่นกัน เนื่องจากกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคัลมีลักษณะการสแกนจุด การรับภาพจึงอาจช้า โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับชุดข้อมูลขนาดใหญ่หรือการสร้างภาพความละเอียดสูง แสงเลเซอร์เข้มข้นที่ใช้ในกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคัลอาจสร้างความเสียหายหรือทำให้ตัวอย่างเรืองแสงซีดจางลง ทำให้ระยะเวลาในการสังเกตลดลงและส่งผลต่อคุณภาพของข้อมูล กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคัลมีราคาแพงในการซื้อและบำรุงรักษา ต้องใช้อุปกรณ์เฉพาะทางและบุคลากรที่มีการฝึกอบรม
สำรวจกลุ่มผลิตภัณฑ์ Cellular Stains ของ Atlantis Bioscience รวมถึงฟัลโลอิดิน DNA ของนิวเคลียส เยื่อหุ้มเซลล์ ไมโตคอนเดรีย และอื่นๆ อีกมากมาย!
7 รูป: การเปรียบเทียบระหว่างกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคัลและกล้องจุลทรรศน์แบบเร้าสองโฟตอน (ขวา) รูปภาพของกลุ่มเส้นเลือดใต้ผิวหนังของฉลามที่ย้อมด้วยฟลูออเรสซีน คอนทราสต์ของภาพคอนโฟคัล (A) ลดลงอย่างมีนัยสำคัญที่ 70 µm ในขณะที่การกระตุ้นด้วยโฟตอนสองตัวช่วยให้สามารถรวบรวมภาพที่มีคอนทราสต์ความเข้มที่ยอดเยี่ยมได้แม้จะอยู่ที่ 140 µm (ซ้าย)
ที่มา: doi: 10.1371/journal.pbio.0030207
กล้องจุลทรรศน์แบบหลายโฟตอนหรือกล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอนเป็นเทคนิคการถ่ายภาพขั้นสูงที่ก้าวข้ามขีดความสามารถของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคัลแบบดั้งเดิม เทคนิคนี้ช่วยให้สามารถเจาะเนื้อเยื่อได้ลึกขึ้นและลดการเกิดพิษจากแสง ทำให้เทคนิคนี้เป็นเครื่องมือที่มีคุณค่าอย่างยิ่งในการศึกษาสิ่งมีชีวิต
แทนที่จะใช้โฟตอนเพียงตัวเดียวในการกระตุ้นฟลูออโรโฟร์ กล้องจุลทรรศน์แบบหลายโฟตอนจะใช้โฟตอนสองตัวหรือมากกว่านั้นที่กระทบฟลูออโรโฟร์พร้อมกัน ทำให้ฟลูออโรโฟร์ปล่อยโฟตอนตัวเดียวที่มีพลังงานสูงกว่าออกมา เนื่องจากแสงกระตุ้นอยู่ในสเปกตรัมอินฟราเรด จึงสามารถทะลุเข้าไปในเนื้อเยื่อได้ลึกกว่าเมื่อเทียบกับแสงที่มองเห็นได้ที่ใช้ในกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคัล ทำให้สามารถถ่ายภาพตัวอย่างที่มีความหนากว่าได้ เนื่องจากแสงกระตุ้นมีพลังงานต่ำกว่า จึงลดความเสี่ยงที่ตัวอย่างจะเสียหายจากแสงได้อย่างมาก
กล้องจุลทรรศน์แบบหลายโฟตอนนั้นเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการถ่ายภาพสิ่งมีชีวิตที่มีความหนาเนื่องจากคุณสมบัติพิเศษของมัน กล้องจุลทรรศน์ชนิดนี้เหมาะสำหรับการศึกษาแบบไม่รุกราน เช่น การถ่ายภาพโครงสร้างของสมอง การพัฒนาของตัวอ่อน และสรีรวิทยาของอวัยวะ เนื่องจากกล้องจุลทรรศน์ชนิดนี้สามารถเจาะลึกเข้าไปในเนื้อเยื่อได้ลึกกว่า เนื่องจากมีพิษต่อแสงน้อยกว่า จึงทำให้สามารถถ่ายภาพเซลล์ที่มีชีวิตและสังเกตกระบวนการของเซลล์ที่เปลี่ยนแปลงได้ในระยะยาวได้โดยไม่ก่อให้เกิดความเสียหายอย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ กล้องจุลทรรศน์ชนิดนี้ยังให้ความเป็นไปได้สำหรับ ในร่างกาย การถ่ายภาพเพื่อศึกษาขั้นตอนทางชีวภาพในสิ่งมีชีวิตที่สมบูรณ์ เช่น แบบจำลองของโรคของสัตว์
อุปกรณ์เฉพาะทางที่จำเป็น ได้แก่ เลเซอร์เฟมโตวินาทีกำลังสูงและตัวตรวจจับที่ไวต่อแสง ทำให้กล้องจุลทรรศน์แบบหลายโฟตอนเป็นเทคนิคที่มีราคาแพง แม้ว่าจะลึกกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล แต่ความลึกในการทะลุผ่านยังคงถูกจำกัดโดยการกระเจิงแสงและการดูดกลืนภายในเนื้อเยื่อ ไม่ใช่ฟลูออโรโฟร์ทั้งหมดที่มีประสิทธิภาพในการกระตุ้นด้วยโฟตอนสองตัว ทำให้มีทางเลือกของตัวแทนการติดฉลากจำกัด
กำลังมองหาสีย้อมฟัลโลอิดินสำหรับการถ่ายภาพ 2 โฟตอนอยู่ใช่หรือไม่ ลองดูคอนจูเกตฟัลโลอิดินของเราพร้อมตัวเลือกสีย้อมสำหรับการถ่ายภาพความละเอียดสูงและ 2 โฟตอน
8 รูป: พื้นฐานทางกายภาพของเอพิฟลูออเรสเซนซ์และการส่องสว่าง TIRF (A, B)
การเปรียบเทียบภาพที่ได้จากการใช้เอพิฟลูออเรสเซนต์และ TIRF (C, D)
ที่มา doi: 10.1242/jcs.056218
กล้องจุลทรรศน์ TIRF เป็นเทคนิคการเรืองแสงเฉพาะทางที่ให้ความไวและความละเอียดเชิงพื้นที่ที่ยอดเยี่ยมสำหรับกระบวนการถ่ายภาพที่เกิดขึ้นใกล้กับพื้นผิวเซลล์
เมื่อแสงสะท้อนกลับภายในทั้งหมดที่อินเทอร์เฟซระหว่างตัวกลางสองชนิดที่มีดัชนีหักเหแสงต่างกัน (เช่น แก้วและน้ำ) จะเกิดคลื่นแสงเลือนลางขึ้น คลื่นนี้จะทะลุผ่านระยะทางสั้นๆ (โดยทั่วไปคือ 100-200 นาโนเมตร) เข้าไปในตัวกลางชนิดที่สอง มีเพียงฟลูออโรโฟร์ภายในสนามแสงเลือนลางเท่านั้นที่ถูกกระตุ้น ทำให้การเรืองแสงพื้นหลังจากสารละลายจำนวนมากลดลง ส่งผลให้มีอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนสูง
TIRF มีประโยชน์มากในการแสดงภาพพลวัตของเยื่อหุ้มเซลล์ เช่น ปฏิสัมพันธ์ระหว่างตัวรับและลิแกนด์ การขนส่งระหว่างเวสิเคิลและโปรตีน การดูดซึมเข้าเซลล์ การติดเชื้อไวรัส ปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์กับพื้นผิวเซลล์ หรือพลวัตของโครงร่างเซลล์
ข้อเสียของกล้องจุลทรรศน์ TIRF คือจำเป็นต้องใช้เซลล์เพาะเลี้ยงที่มีการยึดเกาะ ซึ่งจำกัดการใช้งานกับเซลล์แขวนลอยหรือเนื้อเยื่อบางประเภท
9 รูป: ภาพเซลล์สด TauSTED ของเซลล์ U2OS โดยใช้ฉลากสำหรับแอกติน (SiR-แอกติน เรืองแสง) ไมโครทูบูล (SPY555-ทูบูลิน สีฟ้าอมเขียว) และเมมเบรน (CF488A ที่จับคู่กับ WGA สีเขียว)
ที่มา: Leica Microsystems
กล้องจุลทรรศน์ความละเอียดสูงพิเศษเป็นชุดเทคนิคที่ก้าวข้ามขีดจำกัดของการเลี้ยวเบนแสงที่จำกัดความละเอียดของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงโดยทั่วไป สาขาที่ก้าวล้ำนี้ทำให้ความเข้าใจของเราเกี่ยวกับกระบวนการของเซลล์และโมเลกุลเปลี่ยนแปลงไปอย่างมาก
ขีดจำกัดการเลี้ยวเบน ซึ่งเป็นข้อจำกัดทางกายภาพที่กำหนดโดยธรรมชาติของคลื่นแสง จำกัดความละเอียดของกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงทั่วไปให้เหลือประมาณ 200 นาโนเมตร เทคนิคความละเอียดสูงใช้กลยุทธ์ต่างๆ เพื่อหลีกเลี่ยงข้อจำกัดนี้ ทำให้สามารถถ่ายภาพได้ในระดับนาโน (5-20 นาโนเมตร) โดยทั่วไป เทคนิคความละเอียดสูงเกี่ยวข้องกับการระบุตำแหน่งฟลูออโรโฟร์ภายในตัวอย่างอย่างแม่นยำ และการสร้างภาพด้วยคอมพิวเตอร์เพื่อรวมข้อมูลจากเฟรมหรือการวัดหลายๆ เฟรมเพื่อสร้างภาพความละเอียดสูง เทคนิคเหล่านี้สามารถข้ามข้อจำกัดที่กำหนดโดยความยาวคลื่นของแสงได้โดยการจัดการคุณสมบัติการแผ่รังสีของฟลูออโรโฟร์หรือใช้การส่องสว่างแบบมีโครงสร้าง
มีการพัฒนาเทคนิคความละเอียดสูงหลายวิธี โดยแต่ละวิธีมีแนวทางเฉพาะของตนเอง:
กล้องจุลทรรศน์ความละเอียดสูงพิเศษถูกนำไปใช้งานในหลากหลายสาขาในระดับนาโน เช่น การศึกษาโครงสร้างเซลล์และพลวัตของปฏิสัมพันธ์ระหว่างโมเลกุล การถ่ายภาพโครงสร้างละเอียดของไซแนปส์และเครือข่ายนิวรอน การระบุลักษณะของนาโนวัสดุและคุณสมบัติของนาโนวัสดุ และการตรวจสอบพื้นฐานทางโมเลกุลของโรค
กล้องจุลทรรศน์ความละเอียดสูงถึงแม้จะให้รายละเอียดที่ไม่เคยมีมาก่อนแต่ก็ต้องเผชิญกับความท้าทายหลายประการ เมื่อความละเอียดเพิ่มขึ้น ความต้องการทางเทคนิคและข้อจำกัดต่างๆ ก็จะยิ่งเด่นชัดขึ้น ซึ่งรวมถึงความจำเป็นในการใช้ฟลูออเรสเซนต์แบบพิเศษ ความอ่อนไหวต่อปัจจัยด้านสิ่งแวดล้อม เช่น การสั่นสะเทือน และความเสี่ยงต่อการเกิดพิษจากแสง นอกจากนี้ ระบบความละเอียดสูงยังมีความซับซ้อนและมีราคาแพง ซึ่งมักต้องลงทุนด้านอุปกรณ์และความเชี่ยวชาญเป็นจำนวนมาก การสร้างสมดุลระหว่างความต้องการความละเอียดสูงกับการพิจารณาในทางปฏิบัติ เช่น ความสมบูรณ์ของตัวอย่างและความคุ้มทุน ถือเป็นสิ่งสำคัญสำหรับการถ่ายภาพความละเอียดสูงที่ประสบความสำเร็จ
ลองดูสีย้อม CF® และสีย้อมเซลล์ที่ได้รับการตรวจสอบของเราสำหรับกล้องจุลทรรศน์ Super-Resolution
อ้างอิง:
Bhakdi SC, Thaicharoen P. การใช้งานที่ง่ายและการตรวจจับฟลูออโรโฟร์เจ็ดชนิดโดยไม่มีครอสทอล์คในกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบสนามกว้าง วิธีการโปรโตคอล. 2018;1(2):20. เผยแพร่เมื่อวันที่ 2018 มิถุนายน 1 doi:10.3390/mps1020020
Jonkman J, Brown CM. Any Way You Slice It-การเปรียบเทียบเทคนิคกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคัล J Biomol Tech. 2015 ก.ค.;26(2):54-65. doi: 10.7171/jbt.15-2602-003. PMID: 25802490; PMCID: PMC4365987
Mattheyses AL, Simon SM, Rappoport JZ การถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบสะท้อนกลับทั้งหมดภายในสำหรับนักชีววิทยาด้านเซลล์ J Cell Sci. 2010;123(Pt 21):3621-3628. doi:10.1242/jcs.056218
ลูกสูบ DW เมื่อสองดีกว่าหนึ่ง: องค์ประกอบของกล้องจุลทรรศน์อินทราไวทัล PLOS Biol. 2005;3(6):e207. doi:10.1371/journal.pbio.0030207
https://www.sciencelearn.org.nz/images/526-resolving-power-of-microscopes
https://www.aps.org/apsnews/2004/03/lens-crafters-1590-invention-microscope
https://www.microscopeclub.com/bright-field-microscope
https://www.microscopeclub.com/dark-field-microscopy
https://www.microscopyu.com/techniques/phase-contrast/introduction-to-phase-contrast-microscopy
https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/techniques/dic/dicphasecomparison
https://ibidi.com/content/215-widefield-fluorescence
https://www.leica-microsystems.com/science-lab/super-resolution-microscopy-image-gallery
เชื่อมต่อกับผู้เชี่ยวชาญด้านเทคนิคของเรา
คำขอใบเสนอราคา
อย่าพลาดการอัปเดตของเรา
ติดตามเราบนโซเชียลมีเดีย!
ค้นพบ 5 คราบเซลล์ล้ำสมัยที่กระตุ้นให้เกิดการวิจัยโรคมะเร็ง! สำรวจว่านวัตกรรมเหล่านี้เปิดเผยเป้าหมายใหม่และผลักดันการแพทย์เฉพาะบุคคลอย่างไร
Sudan Black B ถูกนำมาใช้เพื่อดับ lipofuscin autofluorescence อย่างไรก็ตาม จะแนะนำพื้นหลังที่ไม่เฉพาะเจาะจง TrueBlack® เป็นอีกทางเลือกหนึ่งที่ใช้กันทั่วไปในการวิจัยด้านประสาทวิทยาศาสตร์
มะเร็งเป็นสาเหตุการเสียชีวิตอันดับต้นๆ ของโลก โดยมีผู้เสียชีวิตด้วยโรคมะเร็งประมาณ 10 ล้านคนในปี 2020 เป็นโรคที่เกิดจากการเติบโตของเซลล์ผิดปกติที่ไม่สามารถควบคุมได้ ซึ่งสามารถแพร่กระจายไปยังส่วนอื่น ๆ ของร่างกายเพื่อสร้างเนื้องอกใหม่ ซึ่งเป็นกระบวนการที่เรียกว่า การแพร่กระจาย ในช่วง 250 ปีที่ผ่านมา
ติดต่อฝ่ายดูแลลูกค้า การขาย และความช่วยเหลือด้านวิทยาศาสตร์ของเรา
ปรึกษาและถามคำถามเกี่ยวกับผลิตภัณฑ์และบริการของเรา
เอกสารประกอบเอกสารข้อมูลด้านเทคนิคและความปลอดภัย คำแนะนำ และอื่นๆ อีกมากมาย...