การเรืองแสง - หรือการเปล่งแสงจากสารที่ไม่ได้รับความร้อนทางร่างกาย - มักใช้ในวิทยาศาสตร์เพื่อให้เห็นภาพของหน่วยงานที่ปกติไม่สามารถมองเห็นได้ด้วยตามนุษย์ ปฏิกิริยาเคมีสามารถใช้เพื่อสร้างการเรืองแสงได้โดยไม่ต้องใช้แหล่งกำเนิดแสงภายนอกในเทคนิคต่างๆ เช่น การเรืองแสงทางชีวภาพและเคมีเรืองแสง อย่างไรก็ตาม การเรืองแสงรูปแบบอื่นต้องใช้แสงจากภายนอกเพื่อกระตุ้นการเรืองแสงภายในสาร รูปแบบหลังของการเรืองแสงเหล่านี้เรียกว่า photoluminescence และรวมถึงการเรืองแสงและการเรืองแสง

ด้านล่างนี้คือภาพรวมโดยย่อของเทคนิคเหล่านี้และวิธีการนำไปใช้ในการวิจัยด้านวิทยาศาสตร์เพื่อชีวิต

เรืองแสงได้

การเรืองแสงทางชีวภาพหมายถึงความสามารถอันทรงพลังในการมองเห็นสิ่งที่เกิดขึ้นภายในสิ่งมีชีวิตผ่านการปล่อยแสงที่มองเห็นได้¹ เทคนิคนี้ช่วยให้นักวิจัยศึกษากระบวนการทางชีววิทยาแบบเรียลไทม์ ในร่างกาย. ได้รับการพัฒนาในช่วงสองสามทศวรรษที่ผ่านมาและส่วนใหญ่ใช้ในสัตว์ขนาดเล็กเพื่อวัตถุประสงค์ในการถ่ายภาพระดับโมเลกุล

การเรืองแสงทางชีวภาพทำงานโดยการตรวจจับแสงที่มองเห็นได้ซึ่งเกิดขึ้นเมื่อเอนไซม์ออกซิไดซ์สารตั้งต้นของโมเลกุล ส่วนใหญ่แล้ว เอ็นไซม์ ซึ่งเรียกว่านักข่าวเรืองแสง คือ ลูซิเฟอเรสหิ่งห้อย² อย่างไรก็ตาม ลูซิเฟอเรสที่คัดลอกมาจากสปีชีส์อื่นก็ถือว่ามีประโยชน์เช่นกัน ลูซิเฟอเรสเหล่านี้มาจากสิ่งมีชีวิต เช่น แมงกะพรุน ปะการัง ด้วง และแบคทีเรีย³ เรนิลลา ยีนนักข่าว luciferase เป็นอีกหนึ่งเอนไซม์ที่ใช้กันทั่วไปในการเรืองแสง⁴

เนื่องจากเนื้อเยื่อของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมไม่มีสารเรืองแสงที่แท้จริง ภาพที่สร้างขึ้นจากการเรืองแสงทางชีวภาพจึงมีอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนสูง และเทคนิคนี้สามารถนำมาใช้เพื่อให้เห็นภาพกิจกรรมภายในอวัยวะภายใน¹ แม้ว่าความไวจำเพาะของการถ่ายภาพเรืองแสงทางชีวภาพจะขึ้นอยู่กับปัจจัยหลายประการ เช่น ความลึกของเซลล์ที่ติดฉลาก ความไวของระบบตรวจจับ และระดับของการแสดงออกของลูซิเฟอเรส ความก้าวหน้าในเทคโนโลยีเครื่องตรวจจับได้ปรับปรุงความไวและคุณภาพของภาพที่ได้⁵

มีการประยุกต์ใช้การวิจัยที่หลากหลายสำหรับการเรืองแสงของสิ่งมีชีวิต รวมถึงการเฝ้าติดตามกิจกรรมพื้นฐาน เช่น ปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนและการเคลื่อนที่ภายในเซลล์ รวมถึงการเฝ้าติดตามกระบวนการที่เกี่ยวข้องทางคลินิกมากขึ้น เช่น ความก้าวหน้าของการติดเชื้อ การเติบโตของเนื้องอกและการแพร่กระจาย การแสดงออกของยีน และผลกระทบของการบำบัดด้วยยีน^{1,6 8-}  การทดสอบยีนนักข่าวที่โดดเด่นที่สุดวิธีหนึ่งที่ใช้ในการพัฒนายา - การทดสอบยีนนักข่าวเรืองแสง - ใช้การเรืองแสงทางชีวภาพเพราะเทคนิคนี้เอื้อต่อกระบวนการคัดกรองปริมาณงานสูงที่เกี่ยวข้อง⁹

เคมีเรืองแสง

เช่นเดียวกับการเรืองแสงของสิ่งมีชีวิต เคมีเรืองแสง เป็นวิธีตรวจจับการปล่อยแสงที่มีความไวสูงซึ่งมีข้อดีคือไม่จำเป็นต้องใช้แหล่งกำเนิดแสงจากภายนอก จึงหลีกเลี่ยงความท้าทายที่เกี่ยวข้องกับการฟอกสีด้วยแสง การกระเจิงของแสง และการเรืองแสงอัตโนมัติ¹⁰  เช่นเดียวกับการเรืองแสงทางชีวภาพ คุณสมบัติของเคมีลูมิเนสเซนซ์นี้เอื้อต่ออัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนที่สูงกว่าวิธีการเรืองแสงแบบอื่นๆ ทำให้เคมีลูมิเนสเซนซ์เป็นเทคนิคที่มีรากฐานมาอย่างดีพร้อมการใช้งานที่หลากหลาย

เมื่อใช้เคมีลูมิเนสเซนซ์ แสงจะถูกตรวจจับเนื่องจากปฏิกิริยาของสารตั้งต้นที่มีออกซิเจนชนิดปฏิกิริยา เคมีลูมิเนสเซนซ์มักใช้ประโยชน์จากกระบวนการที่หัวไชเท้าม้าเปอร์ออกซิเดสเร่งปฏิกิริยาออกซิเดชันของลูมินอลหรือออกซาเลตเอสเทอร์ด้วยไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ แม้ว่าจะมีการใช้สารตั้งต้นอื่นๆ ด้วย¹⁰

ข้อดีของการเรืองแสงด้วยสารเคมีสามารถรับรู้ได้โดยใช้ทั้งสองอย่าง ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย การใช้งาน^11,12 ตัวอย่างเช่น เทคนิคนี้สามารถช่วยในการตรวจหาสารที่วิเคราะห์ได้หลายอย่าง รวมถึงโปรตีน เอนไซม์ กรดนิวคลีอิก และแม้กระทั่งเซลล์^13,14 นอกจากนี้ยังสามารถเปิดใช้งานการตรวจสอบทางสรีรวิทยาและพยาธิวิทยาแบบเรียลไทม์ และดังนั้นจึงมีประโยชน์สำหรับการตรวจสอบแง่มุมของการนำส่งยาและการเติบโตของเนื้องอก¹⁵

แม้ว่าการเรืองแสงด้วยเคมีจะมีข้อดีหลายประการของการเรืองแสงทางชีวภาพ แต่ก็มีข้อเสียอยู่บ้าง ตัวอย่างเช่น ซึ่งแตกต่างจากการเรืองแสงทางชีวภาพ เคมีลูมิเนสเซนซ์ไม่สนับสนุนการตรวจสอบกระบวนการที่เกิดขึ้นในเนื้อเยื่อลึก เนื่องจากเทคนิคนี้มีศักยภาพในการเจาะเนื้อเยื่อที่อ่อนแอ และเอฟเฟกต์การแสดงภาพจะมีอายุสั้น¹⁶

เรืองแสง 

โฟโตลูมิเนสเซนซ์ต้องการให้โมเลกุลดูดซับรังสีแสงและเพื่อให้อิเล็กตรอนของโมเลกุลตื่นเต้น เมื่อสิ่งนี้เกิดขึ้น โมเลกุลจะเปลี่ยนจากสถานะพื้นเป็นสถานะตื่นเต้น เนื่องจากสภาวะที่ตื่นเต้นนั้นไม่เสถียร โมเลกุลจึงเปลี่ยนกลับเป็นสถานะพื้นดินอย่างหลีกเลี่ยงไม่ได้ และทำให้พลังงานกระจายไป

แสงวาว

การเรืองแสงเกิดขึ้นเนื่องจากความแตกต่างของความยาวคลื่นที่น่าตื่นเต้นและเปล่งแสง¹⁷ หลังจากที่โฟตอนของพลังงานแสงถูกดูดกลืน มันจะสูญเสียพลังงานบางส่วนและปล่อยโฟตอนนาโนวินาทีออกมาในภายหลังในสิ่งที่เรียกว่าการเปลี่ยนแปลงของสโตกส์ โฟตอนที่ปล่อยออกมามีพลังงานน้อยกว่า ดังนั้นแสงจึงมีความยาวคลื่นมากกว่าความยาวคลื่นของแสงที่ดูดกลืน

วัตถุเรืองแสงจะมองเห็นได้เมื่อแสงที่ตื่นเต้นถูกปิดกั้น แต่แสงที่ปล่อยออกมาไม่สามารถมองเห็นได้ วิธีการเรืองแสงนี้ให้คอนทราสต์ที่เหนือกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับวิธีการดูดซับที่เกี่ยวข้องกับการย้อมสีด้วยสารที่ดูดซับแสง เช่น คราบแกรม ¹⁸ เนื่องจากสีย้อมเรืองแสงมักจะดูดซับแสงที่แตกต่างจากแบ็คกราวด์เพียงเล็กน้อยเท่านั้น คอนทราสต์ที่ผลิตได้จึงถูกจำกัด¹⁷

การเรืองแสงใช้ในเทคนิคห้องปฏิบัติการทั่วไป ตัวอย่างเช่น blot ตะวันตก (หรืออิมมูโนลอต) ใช้เทคนิคนี้เพื่อช่วยหาปริมาณโปรตีน Flow cytometry ยังใช้ฟลูออโรฟอร์ซึ่งสามารถดูดซับและปล่อยแสงภายในช่วงความยาวคลื่นต่างๆ ร่วมกับแอนติบอดีเพื่อตรวจจับเครื่องหมายทางชีวภาพ

สัญญาณต่อเสียงรบกวนไม่ดีเมื่อใช้แสงเรืองแสงในตัวอย่างเนื้อเยื่อที่หนากว่า เนื่องจากแสงกระตุ้นต้องทะลุผ่านชั้นทางชีวภาพอื่นๆ อีกหลายชั้น ซึ่งนำไปสู่การเรืองแสงอัตโนมัติ ความพยายามบางประการในการปรับปรุงความแตกต่างระหว่างพื้นหลังและเอนทิตีที่น่าสนใจได้นำไปสู่กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง ซึ่งปัจจุบันกลายเป็นชิ้นสำคัญของกล้องจุลทรรศน์ที่ใช้ในการวิจัยทางชีววิทยา¹⁹

การส่องแสงวาวอย่างฟอสฟอรัส

เช่นเดียวกับการเรืองแสง การเรืองแสงเกิดขึ้นเนื่องจากความแตกต่างของความยาวคลื่นของโฟตอนที่ถูกดูดซับและที่ปล่อยออกมา อย่างไรก็ตาม พลังงานจะถูกเก็บและปล่อยในสารเรืองแสงมากกว่าเทคนิคการเรืองแสงมาตรฐาน ดังนั้น การเรืองแสงโดยทั่วไปเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงของสโตกส์ที่ใหญ่กว่ามากและระยะเวลาการปล่อยก๊าซที่นานกว่าการเรืองแสงมาตรฐาน

การใช้ฟอสฟอรัสเซนซ์ได้ขยายวงกว้างขึ้นในช่วงไม่กี่ทศวรรษที่ผ่านมา เนื่องจากมีข้อได้เปรียบเฉพาะบางประการที่ได้รับจากเทคนิคนี้ รวมถึงความไวสูง การเลือกสรร และการตรวจจับแบบแก้ไขตามเวลา นอกจากนี้ แม้ว่าเทคนิคฟอสฟอเรสเซนซ์เคยถูกจำกัดไว้เฉพาะในสถานะของแข็งหรืออุณหภูมิต่ำ แต่แนวทางใหม่ๆ ก็ได้พัฒนาขึ้นเมื่อไม่นานมานี้ที่ช่วยให้สามารถเกิดฟอสฟอรัสในสถานะของเหลวและอุณหภูมิห้องได้

Takeaway

การเรืองแสงเป็นเครื่องมือสำคัญในการวิจัยด้านวิทยาศาสตร์เพื่อชีวิต โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการแสดงภาพโมเลกุลและกระบวนการทางชีววิทยา วิธีการเรืองแสงที่ดีที่สุดขึ้นอยู่กับเป้าหมายเฉพาะของการวิจัย การไปยังส่วนต่างๆ ของแอปพลิเคชันของเครื่องมือเหล่านี้สามารถช่วยอธิบายข้อดีและข้อเสียของเครื่องมือเหล่านี้ได้อย่างชัดเจน

ณิชา คูช, PhD

ดร. นิชา คูช สำเร็จการศึกษาระดับปริญญาเอกสาขาประสาทวิทยาศาสตร์จากคณะแพทยศาสตร์มหาวิทยาลัยแมริแลนด์ ดร. Cooch ได้ทำการวิจัยที่ National Institutes of Health (NIH) และทำหน้าที่เป็น American Association for the Advancement of Science (AAAS) Science and Technology Policy Fellow เธอได้รับการตีพิมพ์ในสื่อยอดนิยมตลอดจนวารสารที่ได้รับการตรวจสอบโดยผู้ทรงคุณวุฒิ เช่น Nature Neuroscience ดูบทความทั้งหมดโดย Nisha Cooch, PhD

อ้างอิง

1. Sadikot RT, แบล็คเวลล์ TS การถ่ายภาพเรืองแสง Proc Am Thorac สังคม. 2005;2(6):511-512,537-540. doi:10.1513/pats.200507-067DS
2. de Wet JR, Wood KV, Helinski DR, DeLuca M. การโคลนนิ่งของหิ่งห้อย luciferase cDNA และการแสดงออกของ luciferase ที่ใช้งานอยู่ใน Escherichia coli Proc Natl Acad Sci สหรัฐอเมริกา. 1985;82(23):7870-7873. doi:10.1073/pnas.82.23.7870
3. เฮสติ้งส์ เจดับบลิว. เคมีและสีของปฏิกิริยาเรืองแสง: บทวิจารณ์ ยีน. 1996;173(1 Spec No):5-11. doi:10.1016/0378-1119(95)00676-1
4. Thorne N, Inglese J, Auld DS ให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับลูซิเฟอเรสหิ่งห้อยและนักข่าวเรืองแสงอื่นๆ ที่ใช้ในชีววิทยาเคมี เคมีไบโอล. 2010;17(6):646-657. doi:10.1016/j.chembiol.2010.05.012
5. วิลสัน ที, เฮสติงส์ เจดับบลิว. สารเรืองแสง แอนนู เรฟ เซลล์ เดฟ ไบออล. 1998;14:197-230. doi:10.1146/annurev.cellbio.14.1.197
6. Tang Y, Shah K, Messerli SM, Snyder E, Breakefield X, Weissleder R. ในการติดตามร่างกายของการย้ายเซลล์ต้นกำเนิดประสาทไปยัง glioblastomas ฮัม ยีน เธอ. 2003;14(13):1247-1254. doi:10.1089/104303403767740786
7. เบนารอน DA, Contag PR, Contag CH. การถ่ายภาพโครงสร้างและการทำงานของสมอง การติดเชื้อและการแสดงออกของยีนในร่างกายโดยใช้แสง Philos Trans R Soc ลอนดอน Ser B, Biol Sci. 1997;352(1354):755-761. doi:10.1098/rstb.1997.0059
8. เดอ อัลเมด้า พีอี, ฟาน แรพพาร์ด เจอาร์เอ็ม, วู เจซี ในสิ่งมีชีวิตเรืองแสงเพื่อติดตามชะตากรรมและการทำงานของเซลล์ Am J Physiol หัวใจ Circ Physiol. 2011;301(3):H663-71. doi:10.1152/ajpheart.00337.2011
9. Miraglia LJ, King FJ, Damoiseaux R. มองเห็นแสง: ตรวจยีนนักข่าวเรืองแสง หน้าจอ Comb Chem ปริมาณงานสูง. 2011;14(8):648-657. doi:10.2174/138620711796504389
10. Yan Y, Shi P, Song W, Bi S. Chemiluminescence และ Bioluminescence Imaging สำหรับ Biosensing and Therapy: ในหลอดทดลองและในมุมมอง Vivo theranostics. 2019;9(14):4047-4065. doi:10.7150/thno.33228
11. Roda A, Pasini P, Guardigli M, Baraldini M, Musiani M, Mirasoli M. ชีวภาพและเคมีในการวิเคราะห์ทางชีวภาพ เฟรเซเนียส เจ แอนนา เคมี. 2000;366(6-7):752-759. doi:10.1007/s002160051569
12. Jansen EH, Buskens CA, van den Berg RH ระบบภาพ CCD ที่ละเอียดอ่อนสำหรับการตรวจจับปฏิกิริยาเคมีเรืองแสง เจ ไบโอลูมิน เคมิลูมิน. 1989;3(2):53-57. doi:10.1002/bio.1170030204
13. Suzuki K, Nagai T. ความคืบหน้าล่าสุดในการขยายกล่องเครื่องมือเคมีเรืองแสงสำหรับการสร้างภาพชีวภาพ Curr Opin เทคโนโลยีชีวภาพ. 2017;48:135-141. doi:10.1016/j.copbio.2017.04.001
14. Hananya N, Shabat D. เส้นทางที่เร่าร้อนระหว่าง Bio- และ Chemiluminescence: จากโพรบที่ใช้ Luciferin ไปจนถึง Dioxetanes ที่กระตุ้นได้ Angew Chem Int Ed ภาษาอังกฤษ. 2017;56(52):16454-16463. doi:10.1002/anie.201706969
15. Niu G, Zhu L, Ho DN และอื่น ๆ การถ่ายภาพเรืองแสงตามยาวของไดนามิกของ Doxorubicin ที่เหนี่ยวนำให้เกิดการตายของเซลล์ theranostics. 2013;3(3):190-200. doi:10.7150/thno.5825
16. Pu K, Chattopadhyay N, Rao J. ความก้าวหน้าล่าสุดของอนุภาคนาโนโพลีเมอร์เซมิคอนดักเตอร์ในการถ่ายภาพโมเลกุลในร่างกาย J รีลีสคอนโทรล. 2016;240:312-322. doi:10.1016/j.jconrel.2016.01.004
17. ลิชท์แมน เจดับบลิว, คอนเชลโล เจเอ กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง วิธีการของแนท. 2005;2(12):910-919. doi:10.1038/nmeth817
18. เบเซอร์รา เอสซี, รอย ดีซี, ซานเชซ ซีเจ, คริสตี้ อาร์เจ, Burmeister DM เทคนิคการย้อมสีที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการตรวจจับแบคทีเรียแกรมบวกและแกรมลบภายในเนื้อเยื่อ BMC Res Notes. 2016;9:216. doi:10.1186/s13104-016-1902-0
19. แซนเดอร์สัน เอ็มเจ, สมิธ XNUMX, ปาร์กเกอร์ที่ XNUMX, นายแพทย์ Bootman กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง โปรโตคอล Cold Spring Harb. 2014;2014(10):pdb.top071795. doi:10.1101/pdb.top071795