오르가노이드와 스페로이드는 생물학 연구의 획기적인 진전을 나타내며, 전통적인 3D 배양보다 인간 조직의 구조와 기능을 더 정확하게 모방하는 고급 2D 모델을 제공합니다. 이러한 XNUMX차원 구조는 자가 조직화를 촉진하는 특수 환경에서 세포를 배양하여 생체 내 기관과 유사한 특성을 가진 복잡한 조직을 형성하여 만들어집니다.

오르가노이드와 스페로이드의 차이점은 무엇인가요?

• 오가 노이드 장기의 소형화된 버전으로, 줄기 세포나 장기 특정 전구체에서 성장하며, 여러 세포 유형과 심지어 해당 장기의 일부 기능적 특성을 개발할 수 있습니다. 간, 신장, 뇌 또는 장과 같은 조직에서 유래한 오르가노이드는 연구자에게 장기 발달, 질병 진행, 심지어 약물에 대한 반응을 연구할 수 있는 강력한 모델을 제공합니다.
• 구면체반면에, 조직 복잡성이 부족하지만 3D 세포 배양과 보다 복잡한 세포 배양 사이에 필수적인 연결을 제공하는 보다 단순화된 2D 세포 집합체입니다. 생체내에서 모델. 구형체는 암세포에서 형성될 수 있으며, 이를 통해 연구자들은 종양 행동, 약물 저항성, 암세포와 미세환경 간의 상호 작용을 연구할 수 있습니다.

모두 오르가노이드와 스페로이드 암 생물학, 약물 발견, 독성학, 재생 의학과 같은 연구 분야를 변화시키고 있습니다. 더욱 생리학적으로 관련성 있는 모델 시스템을 제공함으로써 연구자들은 다음을 수행할 수 있습니다.

• 복잡한 세포 간 상호작용, 세포와 기질 간 상호작용을 연구합니다.
• 환자별 상태를 포함하여 질병을 보다 정확하게 모델링합니다.
• 동물 모델이나 임상 시험에 들어가기 전에 약물의 효능과 독성을 더욱 예측 가능한 방식으로 테스트합니다.

연구에서 이들의 중요성이 커지면서 이러한 3차원 구조를 시각화하고 연구하기 위한 정확한 방법에 대한 필요성이 부각되고 있으며, 생물학적 측면에 대한 의미 있는 통찰력을 얻으려면 염색과 이미징이 중요해졌습니다.

3D 오르가노이드와 스페로이드 염색

연구를 위한 3D 오르가노이드와 스페로이드의 염색은 크기, 밀도 있는 세포 구성, 구조적 무결성을 유지해야 하는 필요성 때문에 복잡한 과정입니다. 이 섹션에서는 주요 과제를 강조하고 염색 및 이미징을 최적화하기 위한 실용적인 팁을 제공합니다.

1. 3D 구조 염색의 과제

• 얼룩의 제한된 침투: 유기체와 구형체의 크기와 밀도로 인해 염색이 균일하게 침투하지 못할 수 있으며, 특히 핵심 부위에서 그렇습니다. 균일한 분포를 보장하기 위해 염색과 항체의 농도를 최적화하고 배양 시간을 연장합니다(필요한 경우 최대 72시간). 부드럽게 교반하면 염색 침투를 개선하는 데 도움이 될 수도 있습니다.
• 높은 배경 신호: 세포외 기질(ECM) 또는 세포 파편의 자가 형광은 특정 염색을 방해하여 높은 배경 잡음을 초래할 수 있습니다. 광학적 클리어링 방법 또는 자가 형광 소광제는 이 문제를 줄이는 데 도움이 되어 신호 대 잡음 비율을 개선할 수 있습니다.
• 3D 구조 보존: 오르가노이드와 구형체는 섬세하며 염색 절차는 구조를 손상시키거나 변형시킬 위험이 있습니다. 부드러운 피펫팅을 사용한 부드러운 취급, 하이드로젤에 포매, 저속 원심분리는 염색하는 동안 이러한 3D 배양의 무결성을 유지하는 효과적인 방법입니다.
• 고정 문제: 과고정은 얼룩 침투를 차단할 수 있고, 과소고정은 약한 신호를 초래할 수 있습니다. 고정 프로토콜은 일반적으로 기관체 또는 구형체의 크기에 따라 4-15분 동안 60% 파라포름알데히드를 사용하여 최적화해야 합니다. 예비 테스트에 따라 프로토콜을 조정합니다.

2. 효과적인 염색을 위한 팁

• 투과성 최적화: 효과적인 투과성은 염색이 유기체에 더 깊이 침투할 수 있도록 하는 데 필수적입니다. 최적화된 농도와 배양 시간을 가진 Triton X-100(0.1-0.5%)과 같은 제제를 사용하면 구조를 손상시키지 않고 염색을 향상시킬 수 있습니다.
• 배양 시간 연장: 3D 모델의 크기를 고려하면 더 긴 배양 시간이 종종 필요합니다. 염색 배양을 24~72시간 연장하면 염료나 항체가 구형체나 기관체의 내부 층으로 침투할 수 있습니다.
• 여러 단계로 이루어진 부드러운 세척: 섬세한 3D 구조를 방해하지 않고 과도한 염색 시약을 제거하려면 부드럽고 여러 단계로 세척하는 것이 필수적입니다. 세척 단계에서는 저속 원심분리 또는 중력 침전을 사용하여 손실이나 손상을 방지합니다.

3. 이미징 기술 적용

• 공초점 현미경 대 광시트 현미경: 전통적인 공초점 현미경은 얇은 조각을 통한 절편에 효과적이지만, 오르가노이드와 같은 더 두꺼운 3D 구조에는 제한될 수 있습니다. 광시트 또는 3광자 현미경은 더 두꺼운 샘플에 대한 더 나은 시각화를 제공하며 XNUMXD로 전체 구조를 포착하는 데 더 효과적입니다.
• Z-스태킹 및 3D 재구성: 유기체와 구형체의 완전한 시각화를 위해서는 Z-스태킹이 필수적입니다. 연구자들은 여러 초점 평면에서 이미지를 획득함으로써 3D 구조를 재구성할 수 있습니다. 획득 후 이미지 재구성 및 분석 소프트웨어(예: Imaris, Fiji)가 이 프로세스를 도울 수 있습니다.
• 광학 클리어링: 오르가노이드는 종종 불투명하여 영상 선명도가 떨어질 수 있습니다. 광학적 클리어링 기술은 투명도를 높여 염색에 영향을 주지 않고 내부 구조를 더 잘 시각화할 수 있습니다.

4. 일반적인 함정과 이를 피하는 방법

• 과도한 염색: 과도한 염색은 특정 신호를 흐리게 만들고, 특히 구형체의 바깥층에서 불균일한 라벨링을 초래할 수 있습니다. 염색을 조심스럽게 적정하고, 최적의 농도를 결정하기 위해 대조군을 실행합니다.
• 부적절한 장착 매체: 장착 매체와 염색된 샘플 간의 굴절률 불일치는 이미지 품질이 좋지 않을 수 있습니다. 3D 조직용으로 설계된 장착 매체를 사용하면 최적의 이미징과 최소한의 왜곡이 보장됩니다.

구형체 염색을 위한 기본 프로토콜

적절한 염색 기술은 세포 구조를 시각화하고 구형체 내의 특정 단백질 발현을 평가하는 데 필수적입니다. 이 섹션에서는 고정, 염색 및 이미징을 포함하는 구형체 염색을 위한 간략한 프로토콜을 설명합니다.

단계 :

1. 고정

• 넓은 구경 피펫 팁을 사용하여 구형체를 조심스럽게 수집하여 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 구형체가 침전되도록 두고 상층액을 조심스럽게 흡입합니다.
• Tip 팁과 원심분리 튜브를 PBS에 1% BSA로 미리 코팅하면 최대 전달 효율을 보장하는 데 도움이 될 수 있습니다.
• 구형체를 4% 파라포름알데히드(PFA)에 15-20분간 실온에서 고정하고, 50 mM Tris/HCl(pH 7.4)로 30분간 담금질합니다. 구형체의 크기에 따라, 더 큰 구형체는 고정 시간이 더 길어질 수 있습니다.
• 고정 후, 구형체를 PBS로 3번 세척합니다(세척 당 5분).
• 참고: 세포는 장기 보관(4년 이상)을 위해 1°C에서 유지될 수 있습니다.

소 혈청 알부민(BSA) 동결건조 pH~7

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Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 10X w/o 칼슘 w/o 마그네슘 10L

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2. 투과성

• 구형체를 0.1-1.0% Triton X-100(또는 대체 투과제)에 PBS로 3시간 동안 실온에서 배양합니다. 구형체 밀도와 염색하려는 분자의 크기에 따라 투과 시간을 조정합니다.
• PBS로 구형체를 다시 세척합니다(세척 3회, 각 세척 당 5분).

3. 블로킹

• 비특이적 염색을 줄이기 위해 구형체를 차단 완충액(예: PBS에 1% BSA와 1% 당나귀 혈청)에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
• 팁: 배경을 줄이려면 2차 항체가 증가된 동물 혈청을 사용하세요.
• 참고: BSA는 일반적으로 차단 단계에 효과적이지만 배경 소음이 높은 경우 주어진 항체 조합에 대해 가능한 가장 좋은 결과를 얻기 위해 경험적 테스트를 수행하십시오.
• 차단 완충액이 고르게 분포되도록 배양하는 동안 가볍게 흔들거나 흔들어주세요.

당나귀 세럼 500ml

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4. 염색

• 염색 용액(예: 1차 항체, 핵 염색약 또는 형광 프로브)을 차단 완충액이 포함된 PBS에 희석하여 준비합니다.
• 구형체를 염색 용액에 24°C에서 72-4시간 동안 배양합니다. 장시간 배양하면 염색이 구형체의 가장 안쪽 세포에 도달합니다.
• 선택적으로 구형체를 가볍게 흔들어(예: 로커나 회전 플랫폼 위) 침투력을 강화합니다.

5. 세척

• 구형체를 PBS로 3-5회 세척하여 결합되지 않은 얼룩을 제거합니다. 세척이 부드럽게 이루어져 구형체의 무결성이 유지되도록 합니다.

6. 필요한 경우 염색

• 24차 항체나 대조 염색이 필요한 경우(예: 48차 항체 검출이나 추가 마커 염색), 구형체를 4차 염색 용액과 함께 XNUMX°C에서 XNUMX~XNUMX시간 더 배양합니다.
• Hoechst 33342를 첨가하고 2°C에서 4시간 더 배양합니다.
• PBS로 3~5번 더 씻습니다.
• 참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있으며, 샘플은 빛으로부터 보호하여 4°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.

훽스트 33342

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7. 설치

• 염색된 구형체를 3D 이미징을 위해 설계된 장착 매체가 있는 유리 슬라이드 또는 이미징 챔버로 옮깁니다. 매체가 이미징 방법과 호환되고 자가 형광을 최소화하는지 확인합니다.

8. 현미경 사용

• 최적의 시각화를 위해 공초점, 광시트 또는 3광자 현미경을 사용하여 염색된 구형체를 이미지화합니다. 획득 설정(Z-스태킹, 레이저 파워)이 XNUMXD 샘플에 맞게 조정되었는지 확인합니다.

구형체, 3D 배양 또는 Matrigel® 배양을 위한 염색

2D 배양과 달리 구형체는 깊이와 조직 측면에서 어려움을 겪어 염색이나 염색을 사용하지 않고는 세포 생존력, 증식 또는 특정 생물학적 마커를 평가하기 어렵습니다. 적절한 염색을 사용하면 연구자는 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하고 세포막과 미토콘드리아와 같은 세포 구성 요소를 추적하고 심지어 세포 사멸과 같은 과정을 모니터링할 수 있습니다. 이를 통해 3D 환경 내에서 세포 행동, 조직 및 치료에 대한 반응을 이해하는 능력이 향상됩니다.

참조 :

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Gonzalez AL, Luciana L, Le Nevé C, et al. 2021차원 오르가노이드 및 구형체 모델의 염색 및 고해상도 이미징. J Vis Exp. 169;(10.3791):62280/2021. 27년 10.3791월 62280일 출판. doi:XNUMX/XNUMX

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Smyrek I, Stelzer EH. 광 시트 현미경을 사용한 대형 전체 마운트 구형체에 대한 면역 형광 염색의 정량적 2017차원 평가. Biomed Opt Express. 3년 8월 2일;484(499):10.1364-8.000484. doi: XNUMX/BOE.XNUMX.