요약

MSC 배양의 품질 관리는 성공적인 암 연구의 초석이며 순도, 생존 가능성 및 기능성을 유지하기 위한 엄격한 표준과 프로토콜의 필요성을 강조합니다. 포괄적인 품질 관리 조치를 구현함으로써 연구자들은 종양학에서 MSC 기반 치료법 ​​및 중재의 신뢰성, 재현성 및 전환 가능성을 보장할 수 있습니다. 암 연구의 발전이 계속 발전함에 따라 MSC 배양의 품질 관리를 우선시하는 것은 암과의 싸움에서 이 놀라운 세포의 전체 치료 잠재력을 활용하는 데 여전히 가장 중요합니다.

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1966년 프리덴슈타인(Friedenstein)과 동료들에 의해 처음 확인된 중간엽줄기세포(MSC)는 골수에서 초기 인식을 넘어 암 연구 및 치료에 중추적인 역할을 하는 것으로 전환되었습니다. 골수, 지방 조직, 탯줄 및 치수를 포함한 다양한 조직에서 유래된 이러한 섬유아세포 유사 다능성 성체 줄기 세포는 자가 재생 및 다양한 세포 계통으로의 분화와 같은 독특한 능력을 나타냅니다. 분야가 발전하면서 국제세포치료학회(ISCT) 특히 종양 표적화 및 면역 조절 특성이 중요한 암 연구의 맥락에서 기능적 특성과 표면 마커 발현을 강조하면서 MSC를 정의하기 위한 최소 기준을 제시했습니다.

MSC 정의: ISCT 기준

ISCT에 따르면 MSC의 특징은 다음과 같습니다. 세 가지 주요 기준:

1. 플라스틱 접착:
   • MSC는 표준 세포 배양 조건에서 플라스틱 표면에 부착되어야 합니다.
2. 다능성:
   • 조골세포, 지방세포, 연골모세포로의 분화능력을 입증해야 한다. 체외에서.
3. 표면 항원 발현:
   • MSC는 CD73, CD90 및 CD105와 같은 특정 표면 항원을 발현해야 하지만, CD11b/CD14, CD19/CD79α, CD34, CD45 및 HLA-DR을 포함한 계통 특이적 마커의 발현은 부족합니다.

MSC 문화 품질 관리 과제 및 고려 사항

이질성과 가변성

MSC 기반 치료법의 광범위한 채택을 방해하는 주요 장애물 중 하나는 분리된 세포의 고유한 이질성입니다. 성장 잠재력, 분화 능력 및 단백질 발현 프로파일의 변화는 다양한 조직 소스 및 생산 과정에서 관찰되었습니다. 이러한 이질성은 MSC 기반 제품의 표준화를 복잡하게 할 뿐만 아니라 치료 효능 및 안전성 프로필에도 영향을 미칩니다.

MSC의 분리 및 문화 확장

임상 절차에서는 세포 배양 방법을 활용하여 특정 조직 공급원에서 얻은 제한된 일차 MSC 집단을 증폭하고 여러 계대를 통해 이를 확장하여 임상적으로 중요한 세포 수를 달성합니다. MSC 격리 및 확장을 위해 보편적으로 허용되는 프로토콜이 없기 때문에 상당한 변동이 발생합니다. 체외에서 연구 주체 전반의 문화 기술. 이러한 가변성은 여러 연구에 걸친 결과의 비교를 복잡하게 만듭니다.

효과적인 확장 전략은 MSC의 치료 잠재력을 보존하면서 세포 수를 실질적으로 향상시키기 위해 노력합니다. 특히, MSC는 시간이 지남에 따라 그리고 연속적인 계대에 따라 증식률이 감소하여 결국 성장이 중단되는 노화 상태에 도달합니다. 또한 배양 기간이 길어지면 세포의 분화 능력이 손상될 수 있습니다.

따라서 표준화된 프로토콜의 확립, 배양 조건의 최적화 및 엄격한 품질 관리 조치의 구현은 다양한 배치에서 일관된 MSC 특성과 기능을 유지하는 데 필수적입니다.

MSC 문화 주요 품질 관리 매개변수

세포 표면 항원(CD 마커)의 발현

ISCT는 연구자들이 MSC를 골수 구획의 다른 세포와 구별할 수 있도록 하는 일련의 양성 및 음성 마커를 제안했습니다. 음성 마커는 조혈 세포에 의해 발현되는 표면 항원을 포함하도록 선택되었으며, 양성 마커는 대부분의 조혈 세포에 존재하지 않는 것으로 선택되었습니다.

2006년 ISCT 제안 마커가 발표된 이후 몇 가지 추가 마커가 MSC 마커로 널리 수용되었습니다. MSC 관련 마커의 확장 패널을 통해 연구자들은 여러 MSC 관련 표면 항원의 발현을 동시에 확인할 수 있으므로 분리된 MSC의 식별 및 검증에 대한 신뢰도가 높아집니다. 널리 사용되는 일부 MSC 마커에는 CD29, CD44, CD146, CD166, CD271 및 STRO-1이 포함됩니다.

마커 발현 분석은 일반적으로 개별 세포의 표현형을 밝힐 수 있는 유세포 분석을 사용하여 수행됩니다. 다색 유세포 분석을 통해 사용자는 여러 마커를 동시에 검사할 수 있습니다. 또한 많은 유세포 분석기에는 특정 MSC 집단을 풍부하게 하고 분석에서 죽은 세포를 제거하는 데 사용할 수 있는 세포 분류 기능이 장착되어 있습니다.

세포 생존력 및 증식

수확된 MSC의 생존 가능성은 트리판 블루 염색 또는 7-아미노-액티노마이신 D를 사용하여 평가할 수 있습니다.7-AAD) 제외 방법. 즉시 적용된 MSC로 최적의 임상 결과를 달성하고 냉동 보존 후 허용 가능한 생존 가능성을 보장하려면 일차 생존 가능성이 90%를 초과해야 합니다.

CFU(Colony-Forming Unit) 분석은 MSC의 자가 재생 능력을 평가하는 데 널리 알려진 방법입니다. 이 분석은 조직 배양 플라스틱의 단층 배양에서 클론 생성 밀도로 시딩될 때 MSC가 콜로니 단위를 생성하는 효율성을 정량화합니다. 일반적으로 MSC의 단일 세포 현탁액은 배양 접시에 도말되기 전에 연속 희석을 거칩니다. 일반적으로 8일 또는 10일 쯤에 눈에 띄게 되면 집락을 Giemsa로 염색한 후 계수합니다. 오늘날 CFU-F 분석이 사용됩니다. 체외에서 전임상 연구와 임상 시험 모두를 위한 MSC 제제의 품질을 평가합니다.

삼계통 분화 잠재력

MSC는 특정 조건에서 배양할 때 지방세포, 연골세포, 골세포의 세 가지 뚜렷한 계통으로 분화하는 놀라운 능력이 특징입니다. 성공적인 분화는 계통 마커의 발현을 위해 분화된 세포를 염색하거나 세포의 기능성을 평가함으로써 확인할 수 있습니다. 삼계통 분화의 확인은 MSC 정체성 검증에 대한 탁월한 증거를 제공합니다.

1. 골형성 분화:
   • MSC는 뼈 형성과 광물화를 담당하는 특수 세포인 조골세포로 분화되도록 지시될 수 있습니다. 골형성 분화 과정은 조골세포에 의한 광물화된 세포외 기질의 생산을 포함합니다. 골형성 분화를 평가하기 위해 연구자들은 종종 알칼리성 인산분해효소(ALP)와 같은 특정 마커의 활성을 측정하거나 Alizarin Red S와 같은 염색 기술을 활용하여 성숙한 뼈 형성을 나타내는 칼슘 침전물을 시각화합니다.
2. 지방분화:
   • 지방생성 유도 조건에 노출되면 MSC는 지질 저장에 특화된 세포인 지방세포로 분화할 수 있습니다. 지방생성 분화 과정으로 인해 분화된 세포 내에 지질 방울이 축적됩니다. 지방생성 분화를 확인하기 위해 오일 레드 O 염색이 일반적으로 사용되어 지질 축적을 시각화하고 지방세포 표현형을 확인합니다.
3. 연골 분화:
   • MSC는 연골 특이적 세포외 기질 성분을 생산하는 연골 조직에서 발견되는 일차 세포인 연골 세포로 분화하는 능력을 가지고 있습니다. 연골 분화는 연골 복구 및 재생 적용에 중요합니다. Alcian Blue와 같은 조직학적 염색은 글리코사미노글리칸의 존재를 검출하고 연골 조직의 형성을 확인하며 MSC의 연골 분화 가능성을 검증하는 데 자주 사용됩니다.

MSC 효능 및 치료 잠재력을 평가하기 위한 기능적 분석

동안 체외에서 MSC를 골형성, 연골 생성 및 지방 생성 계통으로 분화하는 것이 기본 특징으로 작용하며, MSC 기반 치료법의 임상 개발에는 효능 분석의 확립이 필요합니다. 이러한 분석의 목표는 MSC의 예상되는 임상 작용 메커니즘과 일치하는 특정 생물학적 기능적 특성을 평가하는 것입니다. 다음은 MSC 효능 및 치료 효능을 평가하기 위해 사용되는 몇 가지 주요 기능 분석입니다.

1. 면역조절 분석:
   • MSC의 면역 조절 특성을 이해하는 것은 면역 관련 질환 및 이식에 대한 잠재적인 응용을 고려할 때 매우 중요합니다. T 세포와 같은 면역 세포와 관련된 공동 배양 분석은 MSC의 면역 억제 효과에 대한 귀중한 통찰력을 제공하여 연구자가 면역 반응을 효과적으로 조절하는 능력을 평가할 수 있도록 합니다.
2. 마이그레이션 및 원점 분석:
   • MSC는 고유한 이동 능력을 갖고 있어 특정 조직 손상 부위나 염증성 미세 환경에 접근할 수 있습니다. 트랜스웰 이동 분석 또는 상처 치유 분석은 다양한 케모카인 또는 자극에 대한 반응으로 MSC 이동을 평가하기 위한 효과적인 플랫폼을 제공하여 원점 복귀 잠재력과 조직 표적화 효율성을 설명합니다.
3. 혈관신생 분석:
   • MSC의 혈관신생 촉진 특성은 조직 재생 및 복구 과정을 향상시키는 데 중요한 역할을 합니다. 내피 세포와 함께 MSC를 공동 배양하는 시험관 내 튜브 형성 분석은 MSC의 혈관 신생 잠재력과 조직 재생 및 상처 치유의 중요한 단계인 새로운 혈관 형성을 자극하는 능력을 평가하기 위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.
4. 측분비 활동 분석:
   • MSC는 성장 인자, 사이토카인, 세포밖 소포체 등 다양한 측분비 인자의 분비를 통해 치료 효과를 발휘합니다. ELISA(효소 결합 면역흡착 분석) 또는 다중 사이토카인 분석과 같은 정량 분석은 MSC 분비 인자에 대한 포괄적인 분석을 촉진하여 측분비 활성 및 치료 잠재력에 대한 통찰력을 제공합니다.
5. 기계적 성질 :
   • 최근 연구에서는 MSC의 강성 및 점탄성 특성과 같은 MSC의 기계적 특성을 탐구하기 시작했으며 이는 MSC의 거동 및 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. 생체내에서. 원자현미경(AFM) 또는 유변학적 분석과 같은 고급 기술은 MSC 기계적 특성에 대한 귀중한 데이터를 제공하여 생물학적 특성 및 치료 적용에 대한 보다 포괄적인 이해에 기여합니다.

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참고자료

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